新(xīn)聞中(zhōng)心
在日常的微量核酸與蛋白質(zhì)定量中(zhōng),大家都會或多(duō)或少的遇到測量不準确的問題。這有(yǒu)時來源于主觀的判斷,也可(kě)能(néng)因為(wèi)與其他(tā)方法的對比。樣品的定量結果與預期值出現一定偏差有(yǒu)時是正常的事情,可(kě)能(néng)是因為(wèi)不同測量方法本身存在的差異,如使用(yòng)Nano儀器與Qubit的結果對比,即NQ比(具(jù)體(tǐ)可(kě)參考“每天都提核酸,聽說過NQ比嗎?”),或者使用(yòng)紫外法對比HPLC的結果。而對于單純的使用(yòng)微量樣品進行基于紫外法的定量,如果出現很(hěn)大的偏差,則可(kě)能(néng)是由于設備、樣品狀态和上樣操作(zuò)等多(duō)種因素造成的,應當引起重視。
根據Implen對來自全球的超微量用(yòng)戶的長(cháng)期追蹤與統計,我們總結出了可(kě)能(néng)的四種大概率原因,希望大家在設備使用(yòng)的過程中(zhōng)多(duō)加注意,輕松的使用(yòng)超微量設備獲得可(kě)靠的結果。
光程漂移
超微量設備由于光程漂移而産(chǎn)生誤差的可(kě)能(néng)性占比為(wèi)35%,是第一大可(kě)能(néng)因素。設備在使用(yòng)一段時間後出現的性能(néng)下降,可(kě)能(néng)是相對普遍的,而對于超微量設備,較大的變數就在于光程系統的準确與漂移。各個品牌都會采用(yòng)精(jīng)密的光程設計,精(jīng)确到微米級别,但随着設備的使用(yòng),細小(xiǎo)的部件磨損或漂移也可(kě)能(néng)導緻光程的偏差,進一步表現為(wèi)測量結果的偏差。且這種偏差将會被放大,這是由于設備的光程虛拟稀釋倍數造成的 – 吸光值測量結果需要乘以光程倍數,而同時誤差也将被放大同樣的倍數。
不同的設備可(kě)能(néng)有(yǒu)不同的光程切換設計,一些結構在切換的過程中(zhōng)将會産(chǎn)生機械切割,需要通過維護和光程校準,修複偏差,可(kě)參考廠家的說明書或維護指南。Implen所采用(yòng)的真實光程技(jì )術:即錨定光程切換技(jì )術,采用(yòng)電(diàn)磁彈片的切換方式,在兩個精(jīng)确定義的光程間切換,無中(zhōng)間位置,可(kě)确保光程的準确性,而無需進行維護和光程校準。
混勻問題&濁度
樣品的均質(zhì)性是濃度測量的前提,由于混勻或濁度的問題導緻的測量誤差,可(kě)能(néng)性占比達30%。以正确的方式混勻樣品,是測量前的必要步驟,可(kě)通過渦旋、離心、震蕩、彈撥樣品管等多(duō)種方式實現。一些特殊樣品,槍頭取樣的位置不同也可(kě)能(néng)導緻測量結果不同,如易産(chǎn)生濃度梯度或易沉降的樣品。一些樣品中(zhōng)具(jù)有(yǒu)一定的濁度,雖然可(kě)通過背景校正進行修正,但仍不能(néng)排除由此導緻的測量誤差,濃度測值通常會偏高,需要進行具(jù)體(tǐ)評估。在嚴格的場合下,可(kě)通過雙波長(cháng)或多(duō)元散射校正的方式進行修正。NanoPhotometer®具(jù)有(yǒu)濁度警告功能(néng),可(kě)提示用(yòng)戶較差的樣品質(zhì)量和潛在問題。
樣品&上樣問題
有(yǒu)時樣品本身是存在問題的,和上樣問題一起達到了20%的誤差可(kě)能(néng)性占比。如一些溶解在高鹽緩沖液或在待測波長(cháng)處具(jù)有(yǒu)吸收的緩沖液中(zhōng)的樣品。在空白測量的時候,實際上引入了空白基線(xiàn)的不确定度,樣品測值時可(kě)能(néng)會不穩定,甚至會出現負數。因此,樣品成分(fēn)要具(jù)備方法學(xué)适用(yòng)性。如果确實存在一些具(jù)有(yǒu)共同吸收的成分(fēn),則需要具(jù)體(tǐ)評估結果的可(kě)靠性,或降低置信預期。
一些錯誤的操作(zuò)習慣,尤其是上樣手法,将影響測量結果。如習慣使用(yòng)槍頭塗抹樣品,這将導緻樣品過于平鋪在樣品台上,實際用(yòng)于檢測的樣品量可(kě)能(néng)減少,無法形成液柱,或不滿足實際樣品體(tǐ)積。一些容易有(yǒu)氣泡的樣品,如溶解在甘油中(zhōng)的蛋白質(zhì)樣品,移液時應避免吸入氣泡。黏度較高的樣品可(kě)利用(yòng)反向移液,避免吹出氣泡。
樣品蒸發
在一些場景下,樣品蒸發的問題将産(chǎn)生可(kě)觀的偏差。如設備放置在空調出風口,樣品液柱不可(kě)避免的産(chǎn)生蒸發,将得到偏高的檢測結果(但純度比值通常不會改變)。一些設備如需在層流或生物(wù)安(ān)全櫃中(zhōng)使用(yòng),将影響更大。因此,設備的放置位置需要遵循廠家的手冊,避免這些外部因素影響(包括震動)。采用(yòng)樣品壓縮法的Implen産(chǎn)品,采用(yòng)封閉的檢測環境,可(kě)避免測量過程中(zhōng)蒸發的影響,更可(kě)适用(yòng)于微量樣品動力學(xué)分(fēn)析等應用(yòng)。對于一些含有(yǒu)有(yǒu)機溶劑成分(fēn)的樣品,蒸發的影響更加可(kě)觀,一些因素共同作(zuò)用(yòng),可(kě)能(néng)導緻很(hěn)大的偏差。
以上四類原因是導緻微量分(fēn)光光度計産(chǎn)生測量誤差的常見可(kě)能(néng)因素,有(yǒu)時候可(kě)能(néng)是多(duō)種因素共同作(zuò)用(yòng)導緻測量偏差較大,充分(fēn)了解設備的原理(lǐ)、操作(zuò)方法和樣品狀況,有(yǒu)助于獲得更加可(kě)靠的數據。找出原因,對症下藥,優化實驗過程,更加輕松、省心的進行測量。關于超微量的任何問題,您都可(kě)以咨詢德(dé)國(guó)IMPLEN。