上一期小(xiǎo)賽給大家分(fēn)享了一篇KingFisher純化細胞的文(wén)章，獲得了很(hěn)多(duō)小(xiǎo)夥伴的關注，這次小(xiǎo)賽又(yòu)給您帶來了一篇KingFisher做蛋白純化的文(wén)章，KingFisher儀器不僅能(néng)用(yòng)于新(xīn)冠病毒的檢測，還能(néng)用(yòng)于新(xīn)冠藥物(wù)靶點的研究。

2020年5月，一篇名(míng)為(wèi) “A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing” 的重磅論文(wén)在Nature上發表，推動治療新(xīn)冠藥物(wù)的研發進程。論文(wén)通過揭示SARS-CoV-2病毒與人類蛋白相互作(zuò)用(yòng)（protein–protein interaction, PPI）的圖譜來揭示病毒如何劫持細胞系統，找到了332個SARS-CoV-2蛋白與人類蛋白質(zhì)之間的相互作(zuò)用(yòng)關系，并鑒定出69種能(néng)靶向幹擾的化合物(wù)。這項研究無論對于“老藥新(xīn)用(yòng)”治療新(xīn)冠疾病，還是對于指明新(xīn)藥的研發方向，都有(yǒu)重要的意義。

值得一提的是

科(kē)學(xué)家在研究中(zhōng)使用(yòng)了全自動純化系統KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) 和質(zhì)譜分(fēn)析儀Q Exactive Orbitrap Mass Spectrometers (Thermo Fisher Scientific) 來實現親和純化質(zhì)譜（affinity purification mass spectrometry，AP-MS），找到了藥物(wù)靶點，為(wèi)新(xīn)冠藥物(wù)開發助力。

研究方法

他(tā)們首先單獨研究了 29 種 SARS-CoV-2 蛋白中(zhōng)的 26 種（表1）。

表1. SARS-CoV-2蛋白表，包括分(fēn)子質(zhì)量、與SARS-CoV同源物(wù)的序列相似性以及基于SARS-CoV同源物(wù)的推斷功能(néng)。

如何找到這26種病毒蛋白會與人體(tǐ)裏的哪些蛋白産(chǎn)生相互作(zuò)用(yòng)呢(ne)？

研究人員利用(yòng)在 HEK293T/17 細胞中(zhōng)表達的病毒蛋白進行親和純化質(zhì)譜（AP-MS）。SARS-CoV-2 病毒蛋白經過密碼子優化并克隆到帶有(yǒu)親和标簽（或誘餌）的哺乳動物(wù)表達載體(tǐ)中(zhōng)。在宿主細胞中(zhōng)表達這些病毒蛋白後，通過高通量的純化系統KingFisher Flex，在與宿主蛋白相互作(zuò)用(yòng)的背景下純化病毒蛋白并通過多(duō)次純化洗滌，盡量避免雜蛋白的幹擾。結合質(zhì)譜分(fēn)析得到的數據，生成SARS-CoV-2蛋白和人類蛋白之間的 PPI 圖譜（圖1）。

圖1. AP-MS鑒定SARS-CoV-2宿主蛋白-蛋白質(zhì)相互作(zuò)用(yòng)的實驗流程。

根據這些蛋白相互作(zuò)用(yòng)的數據，科(kē)學(xué)家們在已經批準的藥物(wù)、正在臨床試驗的藥物(wù)、以及尚未進入臨床試驗的化合物(wù)中(zhōng)，尋找能(néng)夠選擇性幹擾病毒蛋白-人類蛋白相互作(zuò)用(yòng)的分(fēn)子。

為(wèi)了進一步證明藥物(wù)的抗病毒性，研究團隊與兩個正在實驗室中(zhōng)處理(lǐ) SARS-CoV-2 病毒的研究小(xiǎo)組合作(zuò)，在 Vero 細胞培養病毒檢測中(zhōng)測試病毒。

主要發現1

繪制SARS-CoV-2病毒蛋白與人體(tǐ)蛋白相互作(zuò)用(yòng)網絡

研究團隊首次系統分(fēn)析了SARS-CoV-2在感染過程中(zhōng)可(kě)能(néng)與哪些人類蛋白質(zhì)相互作(zuò)用(yòng)。用(yòng)親和純化質(zhì)譜法（AP-MS）對27個标記的病毒蛋白（26種新(xīn)冠病毒蛋白和1種突變體(tǐ)蛋白）進行分(fēn)析，基于蛋白質(zhì)之間的相互作(zuò)用(yòng)，确定新(xīn)冠蛋白與人類蛋白質(zhì)的作(zuò)用(yòng)關系，并鑒定了332種高置信度新(xīn)冠蛋白-人類蛋白相互作(zuò)用(yòng)網絡（圖2）。

圖2. SARS-CoV-2蛋白-蛋白相互作(zuò)用(yòng)網絡。26種SARS-CoV-2蛋白(紅色菱形)與人類蛋白(圓形;藥物(wù)靶點:橙色;蛋白複合物(wù):黃色;同一生物(wù)過程中(zhōng)的蛋白質(zhì):藍色)之間332種具(jù)有(yǒu)高置信度的相互作(zuò)用(yòng)。

為(wèi)了進一步驗證互作(zuò)蛋白，研究團隊研究了人類相互作(zuò)用(yòng)蛋白的生物(wù)學(xué)功能(néng)、解剖表達模式、SARS-CoV-2感染期間的表達變化以及與宿主-病原體(tǐ)相互作(zuò)用(yòng)蛋白的其他(tā)圖譜。科(kē)學(xué)家發現這些新(xīn)冠病毒蛋白參與基因調控、信号轉導、應激反應等多(duō)個關鍵細胞進程。約40%蛋白互作(zuò)蛋白與内室或者囊泡運輸途徑有(yǒu)關。其中(zhōng)新(xīn)冠病毒會對多(duō)條先天免疫系統通路如幹擾素通路和 NF-κB通路等産(chǎn)生負面影響。此外，兩個調節抗病毒先天免疫信号通路的人類蛋白，也會被新(xīn)冠病毒蛋白所靶向和針對。

主要發現2

篩選幹預蛋白相互作(zuò)用(yòng)網絡的現有(yǒu)藥物(wù)

通過研究蛋白互作(zuò)，科(kē)學(xué)家找到了這些潛在的藥物(wù)靶點。通過整理(lǐ)這些會與新(xīn)冠蛋白相互作(zuò)用(yòng)的蛋白信息，科(kē)學(xué)家們對比FDA的數據，在已經批準的藥物(wù)、正在臨床試驗的藥物(wù)、以及尚未進入臨床試驗的化合物(wù)中(zhōng)，找到了69個能(néng)夠選擇性幹擾新(xīn)冠蛋白與人類蛋白相互作(zuò)用(yòng)的化合物(wù)（圖3）。在這69種化合物(wù)中(zhōng)，27種為(wèi)已經通過FDA批準上市的藥物(wù)，另外還有(yǒu)14種藥物(wù)目前還處于臨床研究階段，剩餘28種還未進入臨床研究。

圖3. 藥物(wù)和人類靶點的網絡。圖中(zhōng)顯示了SARS-CoV-2毒餌與已批準藥物(wù)(綠色)、臨床候選藥物(wù)(橙色)和臨床前候選藥物(wù)(紫色)的蛋白-蛋白相互作(zuò)用(yòng)，以及針對宿主蛋白(白色背景)或已知宿主因子(灰色背景)的實驗活動。

是否這69種化合物(wù)都具(jù)有(yǒu)抗病毒活性呢(ne)？為(wèi)了在體(tǐ)外測試這些藥物(wù)，他(tā)們在紐約和巴黎做了病毒感染性實驗（圖4）。在紐約西奈山(shān)醫(yī)院，他(tā)們開發了一種中(zhōng)通量免疫熒光技(jì )術分(fēn)析(檢測病毒NP蛋白)篩選37種化合物(wù)，研究Vero E6細胞系SARS-CoV-2感染的抑制作(zuò)用(yòng)；在法國(guó)的巴斯德(dé)研究所，另一批科(kē)學(xué)家通過PCR (RT-qPCR)檢測44種藥物(wù)和化合物(wù)。這兩個實驗發現了兩類分(fēn)子能(néng)減少病毒的感染性：mRNA 翻譯抑制劑和 Sigma1 和 Sigma2 受體(tǐ)的預測調節因子。後續研究表明，這些分(fēn)子作(zuò)用(yòng)于病毒入侵細胞之前，可(kě)以起到阻斷病毒感染的作(zuò)用(yòng)。

圖4. 病毒感染性試驗示意圖。

為(wèi)了理(lǐ)解這些抑制劑發揮抗病毒作(zuò)用(yòng)的機制，科(kē)學(xué)家進行了時間過程實驗，在感染前或感染後不同時間添加藥物(wù)。結果顯示（圖5）PB28、佐他(tā)替芬 (Zotatifin) 和羟基氯喹均降低了病毒的檢出，此外，這三種分(fēn)子在病毒侵入後的感染後4小(xiǎo)時内均能(néng)抑制NP的表達。因此，這些分(fēn)子似乎在病毒複制過程中(zhōng)發揮其抗病毒作(zuò)用(yòng)。

圖5. 感染前後添加藥物(wù)的抗病毒作(zuò)用(yòng)區(qū)别。在添加高滴度病毒(MOI = 2)之前或之後添加藥物(wù)，抗病毒效果相似。

在本研究中(zhōng)，KingFisher Flex幫助研究人員解決了以下問題：

1. 純化的均一性。96通量蛋白樣本在親和純化時在同一條件下完成，實驗更嚴謹。

2. 提高實驗效率。AP-MS實驗涉及大量的标簽蛋白純化，全自動純化系統KingFisher Flex代替手工(gōng)操作(zuò)，節約時間，可(kě)重複性強。

3. 實驗準确性。多(duō)檔速度可(kě)調搭配高吸附磁珠，實驗過程中(zhōng)，盡可(kě)能(néng)多(duō)的标簽蛋白被純化出來，提高藥物(wù)靶點研究的準确性。

參考文(wén)獻

David E. Gordon, Gwendolyn M. Jang, et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature 2020, 583, 459–468