上一(yī)期小(xiǎo)賽給大(dà)家分(fēn)享了一(yī)篇KingFisher純化細胞的文章，獲得了很多小(xiǎo)夥伴的關注，這次小(xiǎo)賽又(yòu)給您帶來了一(yī)篇KingFisher做蛋白(bái)純化的文章，KingFisher儀器不僅能用于新冠病毒的檢測，還能用于新冠藥物(wù)靶點的研究。

2020年5月，一(yī)篇名爲 “A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing” 的重磅論文在Nature上發表，推動治療新冠藥物(wù)的研發進程。論文通過揭示SARS-CoV-2病毒與人類蛋白(bái)相互作用（protein–protein interaction, PPI）的圖譜來揭示病毒如何劫持細胞系統，找到了332個SARS-CoV-2蛋白(bái)與人類蛋白(bái)質之間的相互作用關系，并鑒定出69種能靶向幹擾的化合物(wù)。這項研究無論對于“老藥新用”治療新冠疾病，還是對于指明新藥的研發方向，都有重要的意義。

值得一(yī)提的是

科學家在研究中(zhōng)使用了全自動純化系統KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) 和質譜分(fēn)析儀Q Exactive Orbitrap Mass Spectrometers (Thermo Fisher Scientific) 來實現親和純化質譜（affinity purification mass spectrometry，AP-MS），找到了藥物(wù)靶點，爲新冠藥物(wù)開(kāi)發助力。

研究方法

他們首先單獨研究了 29 種 SARS-CoV-2 蛋白(bái)中(zhōng)的 26 種（表1）。

表1. SARS-CoV-2蛋白(bái)表，包括分(fēn)子質量、與SARS-CoV同源物(wù)的序列相似性以及基于SARS-CoV同源物(wù)的推斷功能。

如何找到這26種病毒蛋白(bái)會與人體(tǐ)裏的哪些蛋白(bái)産生(shēng)相互作用呢？

研究人員(yuán)利用在 HEK293T/17 細胞中(zhōng)表達的病毒蛋白(bái)進行親和純化質譜（AP-MS）。SARS-CoV-2 病毒蛋白(bái)經過密碼子優化并克隆到帶有親和标簽（或誘餌）的哺乳動物(wù)表達載體(tǐ)中(zhōng)。在宿主細胞中(zhōng)表達這些病毒蛋白(bái)後，通過高通量的純化系統KingFisher Flex，在與宿主蛋白(bái)相互作用的背景下(xià)純化病毒蛋白(bái)并通過多次純化洗滌，盡量避免雜(zá)蛋白(bái)的幹擾。結合質譜分(fēn)析得到的數據，生(shēng)成SARS-CoV-2蛋白(bái)和人類蛋白(bái)之間的 PPI 圖譜（圖1）。

圖1. AP-MS鑒定SARS-CoV-2宿主蛋白(bái)-蛋白(bái)質相互作用的實驗流程。

根據這些蛋白(bái)相互作用的數據，科學家們在已經批準的藥物(wù)、正在臨床試驗的藥物(wù)、以及尚未進入臨床試驗的化合物(wù)中(zhōng)，尋找能夠選擇性幹擾病毒蛋白(bái)-人類蛋白(bái)相互作用的分(fēn)子。

爲了進一(yī)步證明藥物(wù)的抗病毒性，研究團隊與兩個正在實驗室中(zhōng)處理 SARS-CoV-2 病毒的研究小(xiǎo)組合作，在 Vero 細胞培養病毒檢測中(zhōng)測試病毒。

主要發現1

繪制SARS-CoV-2病毒蛋白(bái)與人體(tǐ)蛋白(bái)相互作用網絡

研究團隊首次系統分(fēn)析了SARS-CoV-2在感染過程中(zhōng)可能與哪些人類蛋白(bái)質相互作用。用親和純化質譜法（AP-MS）對27個标記的病毒蛋白(bái)（26種新冠病毒蛋白(bái)和1種突變體(tǐ)蛋白(bái)）進行分(fēn)析，基于蛋白(bái)質之間的相互作用，确定新冠蛋白(bái)與人類蛋白(bái)質的作用關系，并鑒定了332種高置信度新冠蛋白(bái)-人類蛋白(bái)相互作用網絡（圖2）。

圖2. SARS-CoV-2蛋白(bái)-蛋白(bái)相互作用網絡。26種SARS-CoV-2蛋白(bái)(紅色菱形)與人類蛋白(bái)(圓形;藥物(wù)靶點:橙色;蛋白(bái)複合物(wù):黃色;同一(yī)生(shēng)物(wù)過程中(zhōng)的蛋白(bái)質:藍(lán)色)之間332種具有高置信度的相互作用。

爲了進一(yī)步驗證互作蛋白(bái)，研究團隊研究了人類相互作用蛋白(bái)的生(shēng)物(wù)學功能、解剖表達模式、SARS-CoV-2感染期間的表達變化以及與宿主-病原體(tǐ)相互作用蛋白(bái)的其他圖譜。科學家發現這些新冠病毒蛋白(bái)參與基因調控、信号轉導、應激反應等多個關鍵細胞進程。約40%蛋白(bái)互作蛋白(bái)與内室或者囊泡運輸途徑有關。其中(zhōng)新冠病毒會對多條先天免疫系統通路如幹擾素通路和 NF-κB通路等産生(shēng)負面影響。此外(wài)，兩個調節抗病毒先天免疫信号通路的人類蛋白(bái)，也會被新冠病毒蛋白(bái)所靶向和針對。

主要發現2

篩選幹預蛋白(bái)相互作用網絡的現有藥物(wù)

通過研究蛋白(bái)互作，科學家找到了這些潛在的藥物(wù)靶點。通過整理這些會與新冠蛋白(bái)相互作用的蛋白(bái)信息，科學家們對比FDA的數據，在已經批準的藥物(wù)、正在臨床試驗的藥物(wù)、以及尚未進入臨床試驗的化合物(wù)中(zhōng)，找到了69個能夠選擇性幹擾新冠蛋白(bái)與人類蛋白(bái)相互作用的化合物(wù)（圖3）。在這69種化合物(wù)中(zhōng)，27種爲已經通過FDA批準上市的藥物(wù)，另外(wài)還有14種藥物(wù)目前還處于臨床研究階段，剩餘28種還未進入臨床研究。

圖3. 藥物(wù)和人類靶點的網絡。圖中(zhōng)顯示了SARS-CoV-2毒餌與已批準藥物(wù)(綠色)、臨床候選藥物(wù)(橙色)和臨床前候選藥物(wù)(紫色)的蛋白(bái)-蛋白(bái)相互作用，以及針對宿主蛋白(bái)(白(bái)色背景)或已知(zhī)宿主因子(灰色背景)的實驗活動。

是否這69種化合物(wù)都具有抗病毒活性呢？爲了在體(tǐ)外(wài)測試這些藥物(wù)，他們在紐約和巴黎做了病毒感染性實驗（圖4）。在紐約西奈山醫院，他們開(kāi)發了一(yī)種中(zhōng)通量免疫熒光技術分(fēn)析(檢測病毒NP蛋白(bái))篩選37種化合物(wù)，研究Vero E6細胞系SARS-CoV-2感染的抑制作用；在法國的巴斯德研究所，另一(yī)批科學家通過PCR (RT-qPCR)檢測44種藥物(wù)和化合物(wù)。這兩個實驗發現了兩類分(fēn)子能減少病毒的感染性：mRNA 翻譯抑制劑和 Sigma1 和 Sigma2 受體(tǐ)的預測調節因子。後續研究表明，這些分(fēn)子作用于病毒入侵細胞之前，可以起到阻斷病毒感染的作用。

圖4. 病毒感染性試驗示意圖。

爲了理解這些抑制劑發揮抗病毒作用的機制，科學家進行了時間過程實驗，在感染前或感染後不同時間添加藥物(wù)。結果顯示（圖5）PB28、佐他替芬 (Zotatifin) 和羟基氯喹均降低了病毒的檢出，此外(wài)，這三種分(fēn)子在病毒侵入後的感染後4小(xiǎo)時内均能抑制NP的表達。因此，這些分(fēn)子似乎在病毒複制過程中(zhōng)發揮其抗病毒作用。

圖5. 感染前後添加藥物(wù)的抗病毒作用區别。在添加高滴度病毒(MOI = 2)之前或之後添加藥物(wù)，抗病毒效果相似。

在本研究中(zhōng)，KingFisher Flex幫助研究人員(yuán)解決了以下(xià)問題：

1. 純化的均一(yī)性。96通量蛋白(bái)樣本在親和純化時在同一(yī)條件下(xià)完成，實驗更嚴謹。

2. 提高實驗效率。AP-MS實驗涉及大(dà)量的标簽蛋白(bái)純化，全自動純化系統KingFisher Flex代替手工(gōng)操作，節約時間，可重複性強。

3. 實驗準确性。多檔速度可調搭配高吸附磁珠，實驗過程中(zhōng)，盡可能多的标簽蛋白(bái)被純化出來，提高藥物(wù)靶點研究的準确性。

參考文獻

David E. Gordon, Gwendolyn M. Jang, et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature 2020, 583, 459–468