近日
北(běi)京市自然科學基金
資(zī)助的重點研究專題項目
“超高分(fēn)辨冷凍電(diàn)子顯微鏡
成像方法研究與應用”
在該項目支持下(xià)，北(běi)京大(dà)學毛有東教授團隊于2022年4月27日在國際學術期刊Nature雜(zá)志(zhì)在線發表了題爲“USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”的研究論文，闡明了原子水平人源蛋白(bái)酶體(tǐ)動力學調控和構象重編程機制，并在國際上展示了人工(gōng)智能四維重建技術用于大(dà)幅提升時間分(fēn)辨冷凍電(diàn)鏡分(fēn)析精度。
蛋白(bái)酶體(tǐ)功能紊亂與人體(tǐ)多種疾病相關，如癌症、神經退行性疾病和免疫疾病等。蛋白(bái)酶體(tǐ)是美國FDA批準的多種治療癌症的上市小(xiǎo)分(fēn)子藥物(wù)的直接靶标。
在正常細胞中(zhōng)，蛋白(bái)酶體(tǐ)的功能受到多個水平的嚴格調控。去(qù)泛素化酶USP14是主要的蛋白(bái)酶體(tǐ)調控分(fēn)子，被認爲是一(yī)個潛力大(dà)的治療癌症和神經退行性疾病的重要靶标，其小(xiǎo)分(fēn)子抑制劑曾進入過美國一(yī)期臨床研究，但圍繞USP14功能機制的一(yī)系列懸而未決的關鍵問題限制了其靶向藥物(wù)分(fēn)子的開(kāi)發和臨床應用。USP14通過結合26S而被激活，然後以毫秒的時間尺度剪切底物(wù)上的泛素鏈。它是如何被蛋白(bái)酶體(tǐ)激活并調控蛋白(bái)酶體(tǐ)功能的，一(yī)直是研究機構和生(shēng)物(wù)制藥領域期待解決的關鍵科學問題。生(shēng)命分(fēn)子機器通過複雜(zá)的非平衡動力學過程和結構變化來實現其特殊功能，這一(yī)過程進而受到各種複雜(zá)分(fēn)子間相互作用的精準調控。如何在原子水平直接觀察天然态超大(dà)分(fēn)子機器的功能态動力學過程，給現有的原子結構動态分(fēn)析技術提出了挑戰。毛有東教授實驗室長期緻力于發展基于冷凍電(diàn)鏡的動力學重建方法，圍繞蛋白(bái)酶體(tǐ)、炎症小(xiǎo)體(tǐ)等具有重大(dà)臨床應用前景的靶點系統的結構功能、動力學機制和靶向調控分(fēn)子設計深入開(kāi)展交叉研究。課題組前期的系列工(gōng)作揭示了蛋白(bái)酶體(tǐ)的原子架構、組裝原理和降解泛素化底物(wù)的動力學基本規律。
本研究課題進行之初，首先要克服的問題就是“時間分(fēn)辨”。蛋白(bái)酶體(tǐ)降解底物(wù)的過程是很快的，時間尺度在毫秒至秒之間。正常條件下(xià)，想要通過冷凍電(diàn)鏡技術捕獲此過程的中(zhōng)間态結構，是非常困難的。所以，課題組首先要讓這個過程慢(màn)下(xià)來。通過大(dà)量的條件摸索，重建反應動力學體(tǐ)系和優化反應條件，包括優化緩沖體(tǐ)系、反應溫度等條件，課題組優化出較爲可行的實驗方案，從而使得時間分(fēn)辨冷凍電(diàn)鏡技術應用成爲可能，獲得了含時的45,193張USP14-26S複合體(tǐ)降解泛素底物(wù)過程中(zhōng)的冷凍電(diàn)鏡透射圖樣，挑取了3,556,806個USP14-26S-泛素底物(wù)複合體(tǐ)的顆粒圖像。
接下(xià)來面臨的極端挑戰就是“三維分(fēn)類”，冷凍電(diàn)鏡捕獲的複合體(tǐ)圖像需要經過一(yī)系列的分(fēn)類，将它們歸爲不同的構象類别，才能呈現出蛋白(bái)反應的動态過程。USP14結合到26S蛋白(bái)酶體(tǐ)後，使得降解底物(wù)的動力學過程更加複雜(zá)，想要在如此多的異構複合體(tǐ)顆粒圖像中(zhōng)，鑒别出降解過程的各個時态的高分(fēn)辨率非平衡構象，傳統的三維分(fēn)類方法是無法實現的。低精度的三維分(fēn)類将導緻低分(fēn)辯的三維重建，從而無法獲取原子水平的動力學信息，無法對含時的數據賦予自洽的動态變化的物(wù)理意義。課題組結合經過數年自主開(kāi)發的新型深度學習高精度三維分(fēn)類和四維重建方法，捕獲了USP14-26S複合體(tǐ)降解多泛素化底物(wù)過程的13種不同功能中(zhōng)間狀态的高分(fēn)辨率（3.0~3.6埃）非平衡構象，通過時間分(fēn)辨冷凍電(diàn)鏡分(fēn)析，重建了受控蛋白(bái)酶體(tǐ)的完整動力學工(gōng)作周期，并結合分(fēn)子生(shēng)物(wù)學功能和基因突變研究，闡明了USP14和26S相互調控活性的原子結構基礎和非平衡動力學機制。研究發現USP14的活化同時依賴于泛素識别和蛋白(bái)酶體(tǐ)RPT1亞基的結合。出人意料的是，USP14通過别構效應，誘導蛋白(bái)酶體(tǐ)同時沿着兩條并行狀态轉變路徑發生(shēng)構象變化；課題組成功捕獲到了底物(wù)降解中(zhōng)間狀态向底物(wù)抑制中(zhōng)間狀态的瞬時轉化。在底物(wù)降解途徑中(zhōng)，USP14活化變構地重編程AAA-ATP酶馬達的構象景觀（Conformational landscape）和統計分(fēn)布，并刺激20S底物(wù)通道的打開(kāi)，從而觀察到底物(wù)持續轉運過程的ATPase六聚馬達非對稱ATP水解和近乎完整的全周循環周期。USP14-ATPase的動态相互作用，使得ATPase馬達底物(wù)識别與26S自身的去(qù)泛素化酶RPN11催化發生(shēng)去(qù)耦合效應，并在26S的泛素識别、底物(wù)的起始易位和泛素鏈回收過程中(zhōng)引入三個調控檢查點（動力學分(fēn)岔點）。這些發現爲USP14調節26S的完整功能周期提供了新的高分(fēn)辨見解，并爲USP14靶向藥物(wù)治療發現奠定了極爲重要的機制基礎。
圖2. 通過時間分(fēn)辨冷凍電(diàn)鏡分(fēn)析獲取的USP14調控蛋白(bái)酶體(tǐ)底物(wù)降解的并行路徑模型。（Youdong Mao, CC BY 4.0）
這是将人工(gōng)智能四維重建技術用于提升時間分(fēn)辨冷凍電(diàn)鏡分(fēn)析精度，針對重大(dà)疾病靶蛋白(bái)複合體(tǐ)，實現原子水平功能動力學觀測的國際原創成果，展示了一(yī)類新型的蛋白(bái)質複合動力學研究範式。Nature同期在線發表了專欄推介文章，評價該成果是一(yī)項重大(dà)研究，解決了原子水平USP14（泛素特異性肽酶14）活化和其調控蛋白(bái)酶體(tǐ)功能的機制問題。
相關論文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8
轉載：江西立康公衆号 鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/QUyfgibh3gADVPyZQsaPSg
