近日
北京市自然科(kē)學(xué)基金
資助的重點研究專題項目
“超高分(fēn)辨冷凍電(diàn)子顯微鏡
成像方法研究與應用(yòng)”
在該項目支持下，北京大學(xué)毛有(yǒu)東教授團隊于2022年4月27日在國(guó)際學(xué)術期刊Nature雜志(zhì)在線(xiàn)發表了題為(wèi)“USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”的研究論文(wén)，闡明了原子水平人源蛋白酶體(tǐ)動力學(xué)調控和構象重編程機制，并在國(guó)際上展示了人工(gōng)智能(néng)四維重建技(jì )術用(yòng)于大幅提升時間分(fēn)辨冷凍電(diàn)鏡分(fēn)析精(jīng)度。
蛋白酶體(tǐ)功能(néng)紊亂與人體(tǐ)多(duō)種疾病相關，如癌症、神經退行性疾病和免疫疾病等。蛋白酶體(tǐ)是美國(guó)FDA批準的多(duō)種治療癌症的上市小(xiǎo)分(fēn)子藥物(wù)的直接靶标。
在正常細胞中(zhōng)，蛋白酶體(tǐ)的功能(néng)受到多(duō)個水平的嚴格調控。去泛素化酶USP14是主要的蛋白酶體(tǐ)調控分(fēn)子，被認為(wèi)是一個潛力大的治療癌症和神經退行性疾病的重要靶标，其小(xiǎo)分(fēn)子抑制劑曾進入過美國(guó)一期臨床研究，但圍繞USP14功能(néng)機制的一系列懸而未決的關鍵問題限制了其靶向藥物(wù)分(fēn)子的開發和臨床應用(yòng)。USP14通過結合26S而被激活，然後以毫秒(miǎo)的時間尺度剪切底物(wù)上的泛素鏈。它是如何被蛋白酶體(tǐ)激活并調控蛋白酶體(tǐ)功能(néng)的，一直是研究機構和生物(wù)制藥領域期待解決的關鍵科(kē)學(xué)問題。生命分(fēn)子機器通過複雜的非平衡動力學(xué)過程和結構變化來實現其特殊功能(néng)，這一過程進而受到各種複雜分(fēn)子間相互作(zuò)用(yòng)的精(jīng)準調控。如何在原子水平直接觀察天然态超大分(fēn)子機器的功能(néng)态動力學(xué)過程，給現有(yǒu)的原子結構動态分(fēn)析技(jì )術提出了挑戰。毛有(yǒu)東教授實驗室長(cháng)期緻力于發展基于冷凍電(diàn)鏡的動力學(xué)重建方法，圍繞蛋白酶體(tǐ)、炎症小(xiǎo)體(tǐ)等具(jù)有(yǒu)重大臨床應用(yòng)前景的靶點系統的結構功能(néng)、動力學(xué)機制和靶向調控分(fēn)子設計深入開展交叉研究。課題組前期的系列工(gōng)作(zuò)揭示了蛋白酶體(tǐ)的原子架構、組裝(zhuāng)原理(lǐ)和降解泛素化底物(wù)的動力學(xué)基本規律。
本研究課題進行之初，首先要克服的問題就是“時間分(fēn)辨”。蛋白酶體(tǐ)降解底物(wù)的過程是很(hěn)快的，時間尺度在毫秒(miǎo)至秒(miǎo)之間。正常條件下，想要通過冷凍電(diàn)鏡技(jì )術捕獲此過程的中(zhōng)間态結構，是非常困難的。所以，課題組首先要讓這個過程慢下來。通過大量的條件摸索，重建反應動力學(xué)體(tǐ)系和優化反應條件，包括優化緩沖體(tǐ)系、反應溫度等條件，課題組優化出較為(wèi)可(kě)行的實驗方案，從而使得時間分(fēn)辨冷凍電(diàn)鏡技(jì )術應用(yòng)成為(wèi)可(kě)能(néng)，獲得了含時的45,193張USP14-26S複合體(tǐ)降解泛素底物(wù)過程中(zhōng)的冷凍電(diàn)鏡透射圖樣，挑取了3,556,806個USP14-26S-泛素底物(wù)複合體(tǐ)的顆粒圖像。
接下來面臨的極端挑戰就是“三維分(fēn)類”，冷凍電(diàn)鏡捕獲的複合體(tǐ)圖像需要經過一系列的分(fēn)類，将它們歸為(wèi)不同的構象類别，才能(néng)呈現出蛋白反應的動态過程。USP14結合到26S蛋白酶體(tǐ)後，使得降解底物(wù)的動力學(xué)過程更加複雜，想要在如此多(duō)的異構複合體(tǐ)顆粒圖像中(zhōng)，鑒别出降解過程的各個時态的高分(fēn)辨率非平衡構象，傳統的三維分(fēn)類方法是無法實現的。低精(jīng)度的三維分(fēn)類将導緻低分(fēn)辯的三維重建，從而無法獲取原子水平的動力學(xué)信息，無法對含時的數據賦予自洽的動态變化的物(wù)理(lǐ)意義。課題組結合經過數年自主開發的新(xīn)型深度學(xué)習高精(jīng)度三維分(fēn)類和四維重建方法，捕獲了USP14-26S複合體(tǐ)降解多(duō)泛素化底物(wù)過程的13種不同功能(néng)中(zhōng)間狀态的高分(fēn)辨率（3.0~3.6埃）非平衡構象，通過時間分(fēn)辨冷凍電(diàn)鏡分(fēn)析，重建了受控蛋白酶體(tǐ)的完整動力學(xué)工(gōng)作(zuò)周期，并結合分(fēn)子生物(wù)學(xué)功能(néng)和基因突變研究，闡明了USP14和26S相互調控活性的原子結構基礎和非平衡動力學(xué)機制。研究發現USP14的活化同時依賴于泛素識别和蛋白酶體(tǐ)RPT1亞基的結合。出人意料的是，USP14通過别構效應，誘導蛋白酶體(tǐ)同時沿着兩條并行狀态轉變路徑發生構象變化；課題組成功捕獲到了底物(wù)降解中(zhōng)間狀态向底物(wù)抑制中(zhōng)間狀态的瞬時轉化。在底物(wù)降解途徑中(zhōng)，USP14活化變構地重編程AAA-ATP酶馬達的構象景觀（Conformational landscape）和統計分(fēn)布，并刺激20S底物(wù)通道的打開，從而觀察到底物(wù)持續轉運過程的ATPase六聚馬達非對稱ATP水解和近乎完整的全周循環周期。USP14-ATPase的動态相互作(zuò)用(yòng)，使得ATPase馬達底物(wù)識别與26S自身的去泛素化酶RPN11催化發生去耦合效應，并在26S的泛素識别、底物(wù)的起始易位和泛素鏈回收過程中(zhōng)引入三個調控檢查點（動力學(xué)分(fēn)岔點）。這些發現為(wèi)USP14調節26S的完整功能(néng)周期提供了新(xīn)的高分(fēn)辨見解，并為(wèi)USP14靶向藥物(wù)治療發現奠定了極為(wèi)重要的機制基礎。
圖2. 通過時間分(fēn)辨冷凍電(diàn)鏡分(fēn)析獲取的USP14調控蛋白酶體(tǐ)底物(wù)降解的并行路徑模型。（Youdong Mao, CC BY 4.0）
這是将人工(gōng)智能(néng)四維重建技(jì )術用(yòng)于提升時間分(fēn)辨冷凍電(diàn)鏡分(fēn)析精(jīng)度，針對重大疾病靶蛋白複合體(tǐ)，實現原子水平功能(néng)動力學(xué)觀測的國(guó)際原創成果，展示了一類新(xīn)型的蛋白質(zhì)複合動力學(xué)研究範式。Nature同期在線(xiàn)發表了專欄推介文(wén)章，評價該成果是一項重大研究，解決了原子水平USP14（泛素特異性肽酶14）活化和其調控蛋白酶體(tǐ)功能(néng)的機制問題。
相關論文(wén)鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8
轉載：江西立康公(gōng)衆号 鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/QUyfgibh3gADVPyZQsaPSg
