新聞中(zhōng)心
來源：賽默飛電(diàn)子商(shāng)務平台
01
目标模闆濃度太低
在qPCR 中(zhōng)體(tǐ)現爲CT值偏大(dà)，複孔重複性不佳。
可能的原因1
基因表達豐度低
優化建議：選擇高靈敏度、熒光信号強、更寬動态範圍的qPCR試劑對付低豐度模闆；
可能的原因2
模闆稀釋過度
優化建議：提高模闆濃度(濃縮)，減少模闆稀釋度（理論上每稀釋10倍，CT 值大(dà) 3.3）；
可能的原因3
模闆有降解
優化建議：重新制備模闆，注意選擇好的RNA純化Kit，避免RNA降解，優化逆轉錄條件。
02
擴增效率異常
擴增效率偏離(lí)100%±10% 應考慮優化。Ct值出現太晚的潛在原因之一(yī)是擴增效率低，導緻效率低的原因可能有
可能的原因1
反應條件未優化
優化建議：可以在同一(yī)實驗中(zhōng)預設不同退火(huǒ)溫度，選擇Ct值較小(xiǎo)且平台期熒光強度高的那個溫度；
可能的原因2
存在PCR反應抑制劑
優化建議：一(yī)般反應抑制劑多爲模闆帶入，可考慮重新制備模闆或者稀釋模闆從而降低抑制劑水平；選擇反應性能強健、更耐受抑制劑 的試劑有助于減少此類因素影響；
可能的原因3
模闆擴增區域有複雜(zá)二級結構，高GC含量，影響擴增效率
優化建議：同一(yī)目标設計多個擴增區域/避開(kāi)二級結構複雜(zá)的區域；選擇性能強健耐受性高的預混液，都是可行的解決方法。
03
PCR産物(wù)過長影響擴增效率
優化建議：
縮短PCR産物(wù)長度，控制在100 bp-150 bp之内
優化建議：
嘗試标準的三步擴增提高擴增效率
優化建議：
加長延伸時間使得反應完全，以提高擴增産量
04
無Ct值
可能的原因1
循環數不夠
優化建議：一(yī)般反應設置爲40個，必要時可增加到45個循環；
可能的原因2
信号采集設置不當
優化建議：兩步擴增一(yī)般将信号采集設置在退火(huǒ)延伸階段，三步擴增程序應當将信号采集設置在72℃延伸階段。探針法通常在退火(huǒ)結束時或延伸結束時采集信号。
01
樣本重複性差
優化建議：
取材部位/處理方式/時間應嚴謹地保障一(yī)緻；選擇穩定可靠的試劑盒進行樣本制備（如RNA純化盡量選離(lí)心柱，帶去(qù)除gDNA的）、提取後對RNA的完整度和純度進行檢驗，減少樣本質量重複性差。
02
技術重複性差
分(fēn)爲複孔重複性差（複孔之間ΔCt<0.5就算重複性良好），不同次跑的闆間重複性差。
排查方向有以下(xià)——
1
模闆濃度低容易出現複孔重複性差，若同時Ct值偏大(dà)，可嘗試提高模闆量。條件允許的話(huà)，增加複孔數，棄掉偏差大(dà)的值也好辦法。
2
加樣誤差是同時影響孔間和闆間重複性的常見原因。良好的操作習慣有助于提高實驗重複性，包括：定期校準加樣器能減少不同時期之間的加樣體(tǐ)積偏差；選擇預混液能減少加樣誤差影響孔間重複性；低吸附耗材能減少試劑挂壁；穩定的操作環境溫度，反應前充分(fēn)混勻樣品和試劑和離(lí)心除氣泡避免影響讀數，都有助于減少孔間差異和闆間差異。注意儀器上不同位置的孔溫度一(yī)緻性也可能影響孔間一(yī)緻性。
3
試劑的配液穩定性也值得重視。有時候，配置好的反應闆不一(yī)定能馬上上機，等待時長難以确定，導緻闆間誤差過大(dà)——若預混液能保持足夠長時間的穩定性，可确定第一(yī)個檢測闆的結果與一(yī)個檢測闆的結果相匹配，同時還能提高工(gōng)作流程的整體(tǐ)便利性。
4
試劑的批間一(yī)緻性是影響重複性、實驗前後可比較性的重要因素。定量PCR反應體(tǐ)積很小(xiǎo)且靈敏度高，不同批次試劑的痕量偏差都可能影響結果穩定。盡量選擇同一(yī)批次/批号的試劑，選擇信譽可靠、批間一(yī)緻性高的産品，有助于提高實驗重複性和結果可比較性。
用SYBR Green可以通過測熔解曲線來分(fēn)析确認反應産物(wù)特異性，熔解曲線是随溫度升高DNA雙螺旋結構解開(kāi)程度的曲線：單尖峰提示産物(wù)隻有一(yī)種；多峰則提示有不止一(yī)個産物(wù)，比如引物(wù)二聚體(tǐ)或者非特異擴增。
排查方向有以下(xià)——
02
非特異擴增
排查特征：
電(diàn)泳檢測；雜(zá)峰Tm值在80℃之後，目标峰之後的多爲非特異擴增；
優化建議：
引物(wù)設計特異性不好或者模闆質量不佳（如含有基因組污染）都可能導緻非特異擴增
——建議考慮重新設計引物(wù)或者重新制備模闆（記得在RNA純化中(zhōng)用DNase處理降解gDNA）
另外(wài)，非特異擴增也可能來自反應退火(huǒ)開(kāi)始前各種非特異延伸，和“實驗室某個角落or空氣中(zhōng)的前任、前前任qPCR” DNA污染！帶有UDG和dUTP配方設計的預混液可一(yī)步消除掉這類非特異産物(wù)；再加上抗體(tǐ)暫時封閉酶活的熱啓動設計，既能防止退火(huǒ)前的非特異反應，又(yòu)能在退火(huǒ)同時迅速釋放(fàng)酶活，讓反應更快速高效率。
Tips:
1
熔解曲線不理想還可嘗試兩步法，因爲二步法擴增特異性高。
2
單峰Tm值在80℃之前考慮沒有模闆的可能性
3
單峰不尖要考慮可能有大(dà)小(xiǎo)接近的非特異擴增
4
Mg2+離(lí)子濃度超過3mM以上則易形成引物(wù)二聚體(tǐ)，選擇一(yī)管全包條件已優化的預混液就不用考慮
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A
兼顧高靈敏度和高特異性：
保障檢測的特異性同時具有更小(xiǎo)的Ct 值，低檢出限5拷貝
B
高強度熒光信号：
更大(dà)的擴增曲線dRn值，更高的平台期熒光信号
C
寬動态範圍：
可在跨6個對數級動态範圍内進行精準檢測，并确定可靠的線性
D
桌面穩定性高：
配置好的qPCR反應體(tǐ)系可以在室溫下(xià)穩定保存72小(xiǎo)時
E
批間一(yī)緻性高：
生(shēng)産過程遵循ISO 9001質量管理體(tǐ)系，保障數據的穩定性和重複性
F
抗殘留污染：
采用UDG和dUTP配方，杜絕殘留擴增産物(wù)污染造成的假陽性結果
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