01

OD600的應用(yòng)--幫助了解細菌的生長(cháng)狀态

OD600是指在600nm波長(cháng)處的吸光值，常常被用(yòng)于分(fēn)析細菌生長(cháng)和進行抗生素敏感性測試，在細菌檢測中(zhōng)，測量波長(cháng)需要選擇在生物(wù)材料吸光度最小(xiǎo)的範圍内。因此，這些細菌生長(cháng)曲線(xiàn)測量通常使用(yòng)600-670nm左右的紅色波長(cháng)。在細菌連續培養過程中(zhōng)，在不同的時間點檢測菌液的OD600值，然後以時間為(wèi)橫坐(zuò)标，OD600為(wèi)縱坐(zuò)标，描繪細菌的生長(cháng)曲線(xiàn)。結合生長(cháng)曲線(xiàn)，可(kě)以評估細菌所處的生長(cháng)階段，進而可(kě)以确定合适的誘導表達或收獲的時間點。

02

OD600 測量菌液/細胞濃度的原理(lǐ)

細菌密度的測量方式是通過光的散射，也就是看渾濁程度而不是吸光度，光的散射程度反應的是細胞的生物(wù)質(zhì)量而不是細胞個數，也稱濁度測量。濁度法測量非均質(zhì)溶液中(zhōng)是否存在固體(tǐ)顆粒。固體(tǐ)顆粒可(kě)以是細胞、沉澱、聚集體(tǐ)或溶液中(zhōng)存在的任何其他(tā)固體(tǐ)物(wù)質(zhì)。顆粒會散射光束中(zhōng)的光子，因此儀器檢測器會檢測到較低的光強度。這種現象與吸光度測量截然不同，吸光度測量是指光子被均勻溶液中(zhōng)的特定染料吸收，吸光度和濁度散射的基本區(qū)别如圖 1 所示。

圖1：吸光度和濁度散射的基本區(qū)别, 在吸光度測定中(zhōng)，由于光被樣品吸收，光電(diàn)探測器中(zhōng)的光強會減弱（A）；在濁度測定中(zhōng)，入射光由樣本中(zhōng)的細胞/粒子随機産(chǎn)生散射。這将導緻方向的不确定性。繼續沿直線(xiàn)傳播的光會進入檢測器，光強也會減弱（B）

03

使用(yòng)不同的設備測量OD600細菌濃度可(kě)能(néng)得到不同的數值

對于具(jù)有(yǒu)濁度的樣品，如細菌溶液、細胞培養物(wù)，測量的“吸光值”是由于光散射，而不是溶質(zhì)分(fēn)子光吸收的結果。由于光散射的程度受系統光學(xué)特性(比色池和儀器出口狹縫之間的距離、單色器光學(xué)特性、狹縫幾何特性等)的影響，使用(yòng)不同類型的分(fēn)光光度計測量同一樣品時，可(kě)能(néng)會得到不同的OD600讀數。

那我們來看下主要有(yǒu)哪些原因影響濁度的測量呢(ne)？

一是濁度測量受樣品中(zhōng)顆粒濃度的影響

濁度測量總是在異質(zhì)樣品中(zhōng)進行，一般需要測量96/ 384 孔闆，現在多(duō)數酶标儀通常使用(yòng)相當窄的測量光束。通常情況下，微孔闆光度計的光束直徑不到一毫米，當光束穿過96孔闆的孔時，測量光束隻能(néng)覆蓋樣品體(tǐ)積的很(hěn)小(xiǎo)一部分(fēn)（圖2）。另外，現代微孔闆光度計的采樣時間也很(hěn)短，通常為(wèi)毫秒(miǎo)級，這些對于濁度測量來說并不是最佳選擇會增加變化。比如液體(tǐ)中(zhōng)的固體(tǐ)顆粒并非處于靜止狀态，而是在整個液體(tǐ)中(zhōng)自由漂浮。因此，當樣品中(zhōng)隻有(yǒu)少量固體(tǐ)顆粒時，在重複測量中(zhōng)，相同數量的顆粒出現在光束内的概率很(hěn)低。如果樣品中(zhōng)有(yǒu)100 個顆粒，那麽測量光束區(qū)域内的顆粒數最有(yǒu)可(kě)能(néng)是1個，但随機情況下可(kě)能(néng)是0個或2個，甚至3個。當采樣時間也以毫秒(miǎo)為(wèi)單位時，液體(tǐ)中(zhōng)顆粒的動态流動不會明顯改變單個測量中(zhōng)的這種情況。因此,當OD值較低時，檢測精(jīng)度可(kě)能(néng)會明顯降低，吸光度檢測的 CVs% 也會大于正常值。

同樣，當樣品中(zhōng)的顆粒數量增加到非常多(duō)時，從顆粒上散射的光子會撞擊到另一個顆粒并重新(xīn)散射。這将導緻一些散射光子經過多(duō)次散射後到達檢測器。因此，濁度測量的線(xiàn)性測量範圍總是低于吸光度測量。

二是不同儀器分(fēn)光光度計的設計影響濁度測量

吸光度和濁度測量之間第二個非常重要的區(qū)别是，不同儀器的光學(xué)設計會影響所得到的OD值（圖 3）。因此，不同廠家生産(chǎn)的微孔闆光度計沒法對同一樣品給出相同的OD值。這裏有(yǒu)兩個影響因素：一是光電(diàn)探測器收集窗口的大小(xiǎo)，二是收集狹縫的大小(xiǎo)。探測器窗口越大，收集到的輕微散射光子就越多(duō)，因此觀測到的OD 值就越低。還有(yǒu)一個主要問題是樣品到檢測器的距離。如果檢測器距離樣品很(hěn)遠(yuǎn)，即使是輕微散射光子也會到達檢測器；如果很(hěn)近，即使是強烈散射光子也會被檢測器收集到。因此，這個距離對得出的OD 值影響也很(hěn)大。由于每個制造商(shāng)的光學(xué)設計不同，這兩個參數（距離和探測器的大小(xiǎo)）在兩台不同的儀器中(zhōng)永遠(yuǎn)不會相同。這些因素不會影響吸收測定，因為(wèi)在吸收測定中(zhōng)光束形狀保持不變。檢測器的大小(xiǎo)或距離不會改變到達檢測器的光量。

圖示3：檢測器收集窗口的大小(xiǎo)和與樣品的距離都會改變所測得的OD值，因此不同的儀器會對相同的樣品給出不同的OD值。檢測到的OD值差異很(hěn)容易達到20-40%。

比如下圖中(zhōng)，在濁度測定結果的偏差表明，Multiskan Sky 和 SkyHigh 采用(yòng)了非常相似的光學(xué)設計，因此結果幾乎相同，但Varioskan LUX 和 Multiskan FC 采用(yòng)了不同類型的光學(xué)器件，因此與Sky和SkyHigh有(yǒu)很(hěn)大不同，兩者之間也存在明顯差異。但在吸光度測量方面，所有(yǒu)四款酶标儀的測量結果完全相同。

圖示4：不同型号酶标儀檢測吸光度和濁度的比較

因此，對于OD600測量，不同酶标儀的結果不能(néng)直接進行比較。對于OD600測量，使用(yòng)相同型号的分(fēn)光光度計可(kě)以保障良好的重複結果。而對于不同酶标儀的結果首先需要使用(yòng)适當的校準曲線(xiàn)進行标準化。

常規的酶标儀檢測都具(jù)備了光吸收檢測功能(néng)，賽默飛多(duō)款酶标儀具(jù)有(yǒu)單獨模塊用(yòng)于濁度檢測，比如單功能(néng)酶标儀FC，配有(yǒu)比色杯模塊的Multiskan SkyHigh 以及多(duō)功能(néng)酶标儀Varioskan LUX等，都是核酸、蛋白質(zhì)、菌液濃度及其他(tā)物(wù)質(zhì)測量的多(duō)功能(néng)儀器，可(kě)為(wèi)用(yòng)戶提供完善的解決方案。