01

OD600的應用--幫助了解細菌的生(shēng)長狀态

OD600是指在600nm波長處的吸光值，常常被用于分(fēn)析細菌生(shēng)長和進行抗生(shēng)素敏感性測試，在細菌檢測中(zhōng)，測量波長需要選擇在生(shēng)物(wù)材料吸光度最小(xiǎo)的範圍内。因此，這些細菌生(shēng)長曲線測量通常使用600-670nm左右的紅色波長。在細菌連續培養過程中(zhōng)，在不同的時間點檢測菌液的OD600值，然後以時間爲橫坐标，OD600爲縱坐标，描繪細菌的生(shēng)長曲線。結合生(shēng)長曲線，可以評估細菌所處的生(shēng)長階段，進而可以确定合适的誘導表達或收獲的時間點。

02

OD600 測量菌液/細胞濃度的原理

細菌密度的測量方式是通過光的散射，也就是看渾濁程度而不是吸光度，光的散射程度反應的是細胞的生(shēng)物(wù)質量而不是細胞個數，也稱濁度測量。濁度法測量非均質溶液中(zhōng)是否存在固體(tǐ)顆粒。固體(tǐ)顆粒可以是細胞、沉澱、聚集體(tǐ)或溶液中(zhōng)存在的任何其他固體(tǐ)物(wù)質。顆粒會散射光束中(zhōng)的光子，因此儀器檢測器會檢測到較低的光強度。這種現象與吸光度測量截然不同，吸光度測量是指光子被均勻溶液中(zhōng)的特定染料吸收，吸光度和濁度散射的基本區别如圖 1 所示。

圖1：吸光度和濁度散射的基本區别, 在吸光度測定中(zhōng)，由于光被樣品吸收，光電(diàn)探測器中(zhōng)的光強會減弱（A）；在濁度測定中(zhōng)，入射光由樣本中(zhōng)的細胞/粒子随機産生(shēng)散射。這将導緻方向的不确定性。繼續沿直線傳播的光會進入檢測器，光強也會減弱（B）

03

使用不同的設備測量OD600細菌濃度可能得到不同的數值

對于具有濁度的樣品，如細菌溶液、細胞培養物(wù)，測量的“吸光值”是由于光散射，而不是溶質分(fēn)子光吸收的結果。由于光散射的程度受系統光學特性(比色池和儀器出口狹縫之間的距離(lí)、單色器光學特性、狹縫幾何特性等)的影響，使用不同類型的分(fēn)光光度計測量同一(yī)樣品時，可能會得到不同的OD600讀數。

那我(wǒ)們來看下(xià)主要有哪些原因影響濁度的測量呢？

一(yī)是濁度測量受樣品中(zhōng)顆粒濃度的影響

濁度測量總是在異質樣品中(zhōng)進行，一(yī)般需要測量96/ 384 孔闆，現在多數酶标儀通常使用相當窄的測量光束。通常情況下(xià)，微孔闆光度計的光束直徑不到一(yī)毫米，當光束穿過96孔闆的孔時，測量光束隻能覆蓋樣品體(tǐ)積的很小(xiǎo)一(yī)部分(fēn)（圖2）。另外(wài)，現代微孔闆光度計的采樣時間也很短，通常爲毫秒級，這些對于濁度測量來說并不是最佳選擇會增加變化。比如液體(tǐ)中(zhōng)的固體(tǐ)顆粒并非處于靜止狀态，而是在整個液體(tǐ)中(zhōng)自由漂浮。因此，當樣品中(zhōng)隻有少量固體(tǐ)顆粒時，在重複測量中(zhōng)，相同數量的顆粒出現在光束内的概率很低。如果樣品中(zhōng)有100 個顆粒，那麽測量光束區域内的顆粒數最有可能是1個，但随機情況下(xià)可能是0個或2個，甚至3個。當采樣時間也以毫秒爲單位時，液體(tǐ)中(zhōng)顆粒的動态流動不會明顯改變單個測量中(zhōng)的這種情況。因此,當OD值較低時，檢測精度可能會明顯降低，吸光度檢測的 CVs% 也會大(dà)于正常值。

同樣，當樣品中(zhōng)的顆粒數量增加到非常多時，從顆粒上散射的光子會撞擊到另一(yī)個顆粒并重新散射。這将導緻一(yī)些散射光子經過多次散射後到達檢測器。因此，濁度測量的線性測量範圍總是低于吸光度測量。

二是不同儀器分(fēn)光光度計的設計影響濁度測量

吸光度和濁度測量之間第二個非常重要的區别是，不同儀器的光學設計會影響所得到的OD值（圖 3）。因此，不同廠家生(shēng)産的微孔闆光度計沒法對同一(yī)樣品給出相同的OD值。這裏有兩個影響因素：一(yī)是光電(diàn)探測器收集窗口的大(dà)小(xiǎo)，二是收集狹縫的大(dà)小(xiǎo)。探測器窗口越大(dà)，收集到的輕微散射光子就越多，因此觀測到的OD 值就越低。還有一(yī)個主要問題是樣品到檢測器的距離(lí)。如果檢測器距離(lí)樣品很遠，即使是輕微散射光子也會到達檢測器；如果很近，即使是強烈散射光子也會被檢測器收集到。因此，這個距離(lí)對得出的OD 值影響也很大(dà)。由于每個制造商(shāng)的光學設計不同，這兩個參數（距離(lí)和探測器的大(dà)小(xiǎo)）在兩台不同的儀器中(zhōng)永遠不會相同。這些因素不會影響吸收測定，因爲在吸收測定中(zhōng)光束形狀保持不變。檢測器的大(dà)小(xiǎo)或距離(lí)不會改變到達檢測器的光量。

圖示3：檢測器收集窗口的大(dà)小(xiǎo)和與樣品的距離(lí)都會改變所測得的OD值，因此不同的儀器會對相同的樣品給出不同的OD值。檢測到的OD值差異很容易達到20-40%。

比如下(xià)圖中(zhōng)，在濁度測定結果的偏差表明，Multiskan Sky 和 SkyHigh 采用了非常相似的光學設計，因此結果幾乎相同，但Varioskan LUX 和 Multiskan FC 采用了不同類型的光學器件，因此與Sky和SkyHigh有很大(dà)不同，兩者之間也存在明顯差異。但在吸光度測量方面，所有四款酶标儀的測量結果完全相同。

圖示4：不同型号酶标儀檢測吸光度和濁度的比較

因此，對于OD600測量，不同酶标儀的結果不能直接進行比較。對于OD600測量，使用相同型号的分(fēn)光光度計可以保障良好的重複結果。而對于不同酶标儀的結果首先需要使用适當的校準曲線進行标準化。

常規的酶标儀檢測都具備了光吸收檢測功能，賽默飛多款酶标儀具有單獨模塊用于濁度檢測，比如單功能酶标儀FC，配有比色杯模塊的Multiskan SkyHigh 以及多功能酶标儀Varioskan LUX等，都是核酸、蛋白(bái)質、菌液濃度及其他物(wù)質測量的多功能儀器，可爲用戶提供完善的解決方案。