近日，中(zhōng)國(guó)農業科(kē)學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所王曉鈞團隊在《PLoS Pathogens》雜志(zhì)刊載了題為(wèi) 「Selective usage of ANP32 proteins by influenza B virus polymerase: Implications in determination of host range」的文(wén)章。該文(wén)章系統性地揭示了 B 型流感病毒感染的種間限制機制，發現宿主 ANP32A&B 蛋白是決定 B 型流感病毒聚合酶活性的須關鍵因子。

甲型流感病毒（IAV）和乙型流感病毒（IBV）屬于正粘病毒科(kē)。禽類作(zuò)為(wèi) IAV 的重要宿主，經常将 IAV 跨物(wù)種傳播給哺乳動物(wù)。而 IBV 與 IAV 複制機制類似且受體(tǐ)相同，卻少有(yǒu)禽類自然感染 IBV 的報道，這說明 IBV 在禽類體(tǐ)内無法複制，但具(jù)體(tǐ)機制尚不明确。

圖 2   乙型流感病毒結構示意圖

前期研究已經證明，宿主 ANP32A&B 蛋白在  IAV 聚合酶活性中(zhōng)起到關鍵性作(zuò)用(yòng)，那麽 ANP32 蛋白是否在 IBV 的複制中(zhōng)也具(jù)有(yǒu)類似的功能(néng)呢(ne)？不同物(wù)種的 ANP32 蛋白是否為(wèi) IBV 提供不同的支持？

研究團隊構建出不同的細胞系，利用(yòng)聚合酶雙熒光報告系統等技(jì )術，獲得重大發現，其中(zhōng)兩點尤為(wèi)突出：

1.ANP32A、ANP32B 對于 IBV 的複制起主要作(zuò)用(yòng)，ANP32E 的作(zuò)用(yòng)相對有(yǒu)限；

2.哺乳動物(wù) ANP32A&B 蛋白可(kě)以完全支持 IBV 聚合酶複制，而禽類 ANP32A 由于有(yǒu) 33 個氨基酸的插入以及禽類 ANP32B 由于 129/130 位點的突變，導緻禽類 ANP32A&B 均無法支持 IBV 的複制。

為(wèi)進一步探索不同物(wù)種 ANP32 蛋白支持 IBV 聚合酶活性差異的分(fēn)子機制，該研究利用(yòng) Co-IP，以及基于 Biacore 的表面等離子共振 SPR 等技(jì )術進行相關檢測。

Co-IP 實驗結果顯示： huANP32A 和  chANP32A 對于 IBV 聚合酶具(jù)有(yǒu)相似的結合能(néng)力，但無法給出定量的結合差異分(fēn)析。為(wèi)了解決這個問題，研究人員使用(yòng) Biacore  對 IBV 聚合酶與 ANP32 蛋白進行動力學(xué)/親和力表征。

研究人員使用(yòng) CM5 芯片氨基偶聯 Anti-His 抗體(tǐ)自制 Anti-His 捕獲芯片，随後流經含有(yǒu) His-IBV 聚合酶的細胞裂解液，捕獲 His-IBV 聚合酶。然後将 ANP32 蛋白稀釋到一系列濃度作(zuò)為(wèi)流動相，使用(yòng) Biacore T200 對聚合酶與 ANP32 蛋白進行動力學(xué)/親和力表征。

實驗結果表明：與 Co-IP 結果一緻，huANP32A，chANP32A 和 huANP32A + 33 在 0.15625-5μM 的濃度下均能(néng)與病毒聚合酶結合（圖 4A – 4C）。相反，huANP32A_165T 幾乎不與聚合酶結合（圖 4D）。在另一個僅将兩個聚合酶亞基（PA 和 PB1）固定在 CM5 芯片上的對照實驗中(zhōng)，在 huANP32A 和病毒聚合酶亞基之間未檢測到特異性親和力（圖 4E）。

通過 Biacore 分(fēn)析計算得出 huANP32A，chANP32A 和 huANP32A+ 33 的解離平衡常數（KD）有(yǒu)着顯著差異。huANP32A 與 IBV 聚合酶結合，KD = 0.05418μM，幾乎比 chANP32A 低 3 倍。插入 33 個氨基酸的 huANP32A 和聚合酶結合的 KD 值也從 0.05418μM 增加到 0.1013μM（圖 4F）。盡管 huANP32A，chANP32A 和 huANP32A + 33 具(jù)有(yǒu)相似的解離速率常數（kd），但結合速率常數（ka）卻截然不同。huANP32A 與 His-IBV 聚合酶結合的 ka 值是其他(tā)兩種蛋白質(zhì)的 ka 值的兩倍。

該結果表明，與 ChANP32A 相比，huANP32A 對 IBV 聚合酶具(jù)有(yǒu)更強的結合親和力，并且 33 個氨基酸的插入降低了 ANP32A 與 IBV 聚合酶的結合親和力。

圖 4 IVB 聚合酶與 ANP32 蛋白互作(zuò) Biacore 結果

該研究揭示了哺乳動物(wù) ANP32 家族蛋白是支持 IBV 複制的關鍵宿主蛋白，并明确了禽類 ANP32 蛋白無法支持病毒聚合酶活性的分(fēn)子機制（圖 5）。對理(lǐ)解 IBV 聚合酶功能(néng)、作(zuò)用(yòng)機理(lǐ)和宿主範圍決定因素具(jù)有(yǒu)重要意義，同時可(kě)為(wèi)抗 IBV 藥物(wù)靶點設計和跨物(wù)種傳播的防控提供理(lǐ)論依據。

圖 5 IAV 和 IBV 聚合酶對 ANP32 蛋白的選擇性使用(yòng)及其分(fēn)子基礎

縱觀全文(wén)，Biacore 的技(jì )術優勢清晰易見

1、Biacore 區(qū)分(fēn)出不同物(wù)種、不同氨基酸結構的同源蛋白與 IBV 聚合酶相互作(zuò)用(yòng)的細微差異，這是 Co-IP 等同類技(jì )術所不具(jù)備的，充分(fēn)體(tǐ)現出 Biacore的分(fēn)辨率。

2、Biacore 互作(zuò)信息，幫助研究人員從 KD、ka、kd 等方向表征分(fēn)子相互作(zuò)用(yòng)，定量地闡釋不同分(fēn)子之間相互作(zuò)用(yòng)的異同點，從而幫助科(kē)研人員好的闡明相關的分(fēn)子機制。

3、利用(yòng) Biacore 可(kě)以直接捕獲粗樣品中(zhōng)的目的蛋白，并進行親和力動力學(xué)的表征。這這篇文(wén)章中(zhōng)，研究人員利用(yòng) Anti-His 捕獲芯片，能(néng)夠從細胞裂解液中(zhōng)直接捕獲 His-IBV 聚合酶，并檢測其與 ANP32 蛋白的互作(zuò)。這樣隻需要純化一種蛋白即可(kě)進行的親和力動力學(xué)表征，降低了樣品準備時間與難度。

自 1990 年上市自今，Biacore 經過 30 年的發展，已經成為(wèi)分(fēn)子互作(zuò)檢測的「金标準」，廣泛應用(yòng)到基礎科(kē)研與藥物(wù)開發的多(duō)個領域，累計發表的文(wén)章已經過四萬篇，過 80% 的上市抗體(tǐ)藥物(wù)在研發、申報與生産(chǎn)中(zhōng)都使用(yòng)了 Biacore。