近日，中(zhōng)國農業科學院哈爾濱獸醫研究所王曉鈞團隊在《PLoS Pathogens》雜(zá)志(zhì)刊載了題爲 「Selective usage of ANP32 proteins by influenza B virus polymerase: Implications in determination of host range」的文章。該文章系統性地揭示了 B 型流感病毒感染的種間限制機制，發現宿主 ANP32A&B 蛋白(bái)是決定 B 型流感病毒聚合酶活性的須關鍵因子。

甲型流感病毒（IAV）和乙型流感病毒（IBV）屬于正粘病毒科。禽類作爲 IAV 的重要宿主，經常将 IAV 跨物(wù)種傳播給哺乳動物(wù)。而 IBV 與 IAV 複制機制類似且受體(tǐ)相同，卻少有禽類自然感染 IBV 的報道，這說明 IBV 在禽類體(tǐ)内無法複制，但具體(tǐ)機制尚不明确。

圖 2   乙型流感病毒結構示意圖

前期研究已經證明，宿主 ANP32A&B 蛋白(bái)在  IAV 聚合酶活性中(zhōng)起到關鍵性作用，那麽 ANP32 蛋白(bái)是否在 IBV 的複制中(zhōng)也具有類似的功能呢？不同物(wù)種的 ANP32 蛋白(bái)是否爲 IBV 提供不同的支持？

研究團隊構建出不同的細胞系，利用聚合酶雙熒光報告系統等技術，獲得重大(dà)發現，其中(zhōng)兩點尤爲突出：

1.ANP32A、ANP32B 對于 IBV 的複制起主要作用，ANP32E 的作用相對有限；

2.哺乳動物(wù) ANP32A&B 蛋白(bái)可以完全支持 IBV 聚合酶複制，而禽類 ANP32A 由于有 33 個氨基酸的插入以及禽類 ANP32B 由于 129/130 位點的突變，導緻禽類 ANP32A&B 均無法支持 IBV 的複制。

爲進一(yī)步探索不同物(wù)種 ANP32 蛋白(bái)支持 IBV 聚合酶活性差異的分(fēn)子機制，該研究利用 Co-IP，以及基于 Biacore 的表面等離(lí)子共振 SPR 等技術進行相關檢測。

Co-IP 實驗結果顯示： huANP32A 和  chANP32A 對于 IBV 聚合酶具有相似的結合能力，但無法給出定量的結合差異分(fēn)析。爲了解決這個問題，研究人員(yuán)使用 Biacore  對 IBV 聚合酶與 ANP32 蛋白(bái)進行動力學/親和力表征。

研究人員(yuán)使用 CM5 芯片氨基偶聯 Anti-His 抗體(tǐ)自制 Anti-His 捕獲芯片，随後流經含有 His-IBV 聚合酶的細胞裂解液，捕獲 His-IBV 聚合酶。然後将 ANP32 蛋白(bái)稀釋到一(yī)系列濃度作爲流動相，使用 Biacore T200 對聚合酶與 ANP32 蛋白(bái)進行動力學/親和力表征。

實驗結果表明：與 Co-IP 結果一(yī)緻，huANP32A，chANP32A 和 huANP32A + 33 在 0.15625-5μM 的濃度下(xià)均能與病毒聚合酶結合（圖 4A – 4C）。相反，huANP32A_165T 幾乎不與聚合酶結合（圖 4D）。在另一(yī)個僅将兩個聚合酶亞基（PA 和 PB1）固定在 CM5 芯片上的對照實驗中(zhōng)，在 huANP32A 和病毒聚合酶亞基之間未檢測到特異性親和力（圖 4E）。

通過 Biacore 分(fēn)析計算得出 huANP32A，chANP32A 和 huANP32A+ 33 的解離(lí)平衡常數（KD）有着顯著差異。huANP32A 與 IBV 聚合酶結合，KD = 0.05418μM，幾乎比 chANP32A 低 3 倍。插入 33 個氨基酸的 huANP32A 和聚合酶結合的 KD 值也從 0.05418μM 增加到 0.1013μM（圖 4F）。盡管 huANP32A，chANP32A 和 huANP32A + 33 具有相似的解離(lí)速率常數（kd），但結合速率常數（ka）卻截然不同。huANP32A 與 His-IBV 聚合酶結合的 ka 值是其他兩種蛋白(bái)質的 ka 值的兩倍。

該結果表明，與 ChANP32A 相比，huANP32A 對 IBV 聚合酶具有更強的結合親和力，并且 33 個氨基酸的插入降低了 ANP32A 與 IBV 聚合酶的結合親和力。

圖 4 IVB 聚合酶與 ANP32 蛋白(bái)互作 Biacore 結果

該研究揭示了哺乳動物(wù) ANP32 家族蛋白(bái)是支持 IBV 複制的關鍵宿主蛋白(bái)，并明确了禽類 ANP32 蛋白(bái)無法支持病毒聚合酶活性的分(fēn)子機制（圖 5）。對理解 IBV 聚合酶功能、作用機理和宿主範圍決定因素具有重要意義，同時可爲抗 IBV 藥物(wù)靶點設計和跨物(wù)種傳播的防控提供理論依據。

圖 5 IAV 和 IBV 聚合酶對 ANP32 蛋白(bái)的選擇性使用及其分(fēn)子基礎

縱觀全文，Biacore 的技術優勢清晰易見

1、Biacore 區分(fēn)出不同物(wù)種、不同氨基酸結構的同源蛋白(bái)與 IBV 聚合酶相互作用的細微差異，這是 Co-IP 等同類技術所不具備的，充分(fēn)體(tǐ)現出 Biacore的分(fēn)辨率。

2、Biacore 互作信息，幫助研究人員(yuán)從 KD、ka、kd 等方向表征分(fēn)子相互作用，定量地闡釋不同分(fēn)子之間相互作用的異同點，從而幫助科研人員(yuán)好的闡明相關的分(fēn)子機制。

3、利用 Biacore 可以直接捕獲粗樣品中(zhōng)的目的蛋白(bái)，并進行親和力動力學的表征。這這篇文章中(zhōng)，研究人員(yuán)利用 Anti-His 捕獲芯片，能夠從細胞裂解液中(zhōng)直接捕獲 His-IBV 聚合酶，并檢測其與 ANP32 蛋白(bái)的互作。這樣隻需要純化一(yī)種蛋白(bái)即可進行的親和力動力學表征，降低了樣品準備時間與難度。

自 1990 年上市自今，Biacore 經過 30 年的發展，已經成爲分(fēn)子互作檢測的「金标準」，廣泛應用到基礎科研與藥物(wù)開(kāi)發的多個領域，累計發表的文章已經過四萬篇，過 80% 的上市抗體(tǐ)藥物(wù)在研發、申報與生(shēng)産中(zhōng)都使用了 Biacore。