爲何要檢測内毒素 圖片

爲内毒素無處不在

内毒素又(yòu)稱爲脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，分(fēn)子量範圍爲3,000至4,000Da，由長鏈複合多糖尾部和疏水脂質基團組成（圖1）），是大(dà)多數格蘭氏陰性菌細胞壁的組成部分(fēn)，具有較高的熱穩定性。當細菌在活躍生(shēng)長或在死亡分(fēn)解時，細胞壁中(zhōng)的脂多糖就被釋放(fàng)到周圍環境中(zhōng)。

圖1.脂多糖結構。内毒素爲複合脂多糖，是革蘭氏陰性細菌細胞壁的活性結構成分(fēn)。它們由核心寡糖鏈、O-特異性多糖側鏈（O-抗原）和脂質組分(fēn)（脂質A）組成。

使用如大(dà)腸杆菌(E.coli)生(shēng)産的重組蛋白(bái)，或者提取革蘭氏陰性菌内的核酸時經常遇到内毒素污染問題。内毒素污染的蛋白(bái)質/抗體(tǐ)/核酸在轉染入細胞中(zhōng)或者注入到動物(wù)體(tǐ)内時，可引發強烈的免疫反應，導緻全身性炎症反應綜合征（SIRS）和/或敗血症。因此，内毒素的去(qù)除對于人類疾病治療的注射型藥品、生(shēng)物(wù)制品等都是必須的，尤其對于基因藥物(wù)、蛋白(bái)藥物(wù)、抗體(tǐ)藥物(wù)、疫苗等生(shēng)物(wù)制品的下(xià)遊純化處理來說就顯得非常重要。

中(zhōng)國藥典的規定

細菌内毒素檢查法（通則 1143）包括兩種方法：凝膠法和光度測定法，後者又(yòu)包括濁度法和顯色法，可以選用其中(zhōng)任何一(yī)種方法進行細菌内毒素檢查。凝膠法和光度法各具優點和局限：

凝膠法

凝膠法的優點是操作簡便，供試品在排除幹擾作用後均可使用凝膠法進行檢驗。

凝膠法的幹擾試驗是确定供試品能否使用凝膠法的決定因素。進行幹擾實驗時，應挑選與鲎試劑反應呈陰性的樣品進行幹擾試驗。若樣品稀釋到 MVD(有效稀釋倍數) 仍不能排除幹擾作用，應進一(yī)步對供試品的前處理進行研究，再用幹擾試驗驗證能否使用凝膠法。

光度法

光度法（包括濁度法和顯色法）可定量檢測内毒素的含量，能較爲準确評估産品在生(shēng)産過程中(zhōng)污染的相對風險，定量檢測的數據不僅有利于追蹤産品質量趨勢，還能起到風險預警的作用，更易達到數據完整性的要求。

由于光度法的檢測限範圍比凝膠法寬，使得有幹擾的樣品可以有更大(dà)的稀釋倍數，對于部分(fēn)使用凝膠法無法排除幹擾的樣品，可以嘗試使用光度法建立細菌内毒素檢測方法。

常用實驗方法和幹擾分(fēn)析

鲎試劑是從海洋動物(wù)鲎提取的血細胞溶解物(wù),是檢測革蘭氏陰性細菌内毒素的一(yī)種敏感試劑。其實驗原理如圖2所示：

圖2.鲎試劑的級聯反應。LPS（内毒素）激活質膜結合因子C。活化的因子C激活因子B，活化的因子B激活凝固酶原，生(shēng)成凝血酶。加入顯色底物(wù)Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA後，活化的蛋白(bái)酶-凝血酶催化對硝基苯胺（pNA）的釋放(fàng)，産生(shēng)黃色。通過測量405nm處吸光度值進行定量。根據标準曲線可推算得出結果。紅色表示無活性酶，綠色表示活性酶。

通常實驗流程：

Thermo提供光度法内毒素定量試劑 (A39552）。那麽試劑的品質如何？我(wǒ)們将從靈敏度、數據重複性、抗幹擾性等幾個角度對Pierce内毒素定量試劑盒的性能進行驗證：

數據靈敏度和重複性

提供兩個線性動态範圍：0.01-0.1 EU/mL和0.1-1.0 EU/mL（圖3）。使用此試劑盒的實驗-實驗和操作者-操作者差異系數（CV）爲3%。靈敏度高可以有效地避免内毒素定量中(zhōng)潛在的假陰性或者假陽性。

圖3.Pierce内毒素定量試劑盒的标準曲線。标準曲線顯示出優異的線性度，r2= 0.99。Pierce顯色法内毒素定量試劑盒的較低标準曲線範圍爲0.01-0.1 EU/mL。0.1–1.0 EU/mL标準曲線表示使用内毒素标準品和阿米巴樣細胞裂解物(wù)培養14分(fēn)鍾，随後使用顯色底物(wù)培養6分(fēn)鍾。對于較低濃度，使用内毒素标準品和阿米巴樣細胞裂解物(wù)培養30分(fēn)鍾，随後使用顯色底物(wù)培養6分(fēn)鍾。低濃度标準品（0.01-0.1 EU/mL）顯示出了一(yī)緻性和再現性（n = 17；CV = 3%）。

兼容性

鲎試劑可能受許多因素影響，造成假陰性或假陽性。包括：

i. 反應溫度、樣品酸堿度、離(lí)子強度和金屬離(lí)子（如鎂和鈣）

ii. 血清蛋白(bái)、核酸、脂肪酸、表面活性劑和螯合劑（如EDTA和肝素）可引起内毒素分(fēn)子結構的變化

iii. (1-3)-β-D-葡聚糖的非特異性幹擾：鲎試劑會與其反應，造成假陽性結果

表1.使用Pierce顯色法内毒素定量試劑盒，獲得有效内毒素檢測結果所兼容的高濃度。所列出的濃度是指樣品中(zhōng)添加0.5 EU内毒素時，未使定量值降低的實際濃度。以比例的形式表示稀釋濃度，其中(zhōng)1:100表示100倍稀釋

需要指出的是：Pierce顯色法内毒素定量試劑盒（貨号A39552）與β-葡聚糖兼容，并且在含有10ng/ mL（1,3）-β-D-葡聚糖的樣品中(zhōng)，未顯示出增強作用。

内毒素去(qù)除

超濾、多粘菌素B親和樹(shù)脂以及基于樹(shù)脂或膜的色譜法是内毒素去(qù)除的傳統方法，這些方法在蛋白(bái)回收率、内毒素結合能力等方面具有局限性，有的甚至本身具有毒。

Thermo Fisher Scientific提供高載量内毒素去(qù)除樹(shù)脂(88270)，是基于ε-聚賴氨酸親和樹(shù)脂（天然賴氨酸的聚合物(wù)），顯示出内毒素結合能力和蛋白(bái)質回收率：

➤ 結合力可以達到2,000,000 EU/mL

➤ 在處理初始内毒素水平爲10,000 EU/mL的樣品時，去(qù)除效率可以達到99%以上

圖4.采用Pierce高通量内毒素去(qù)除樹(shù)脂去(qù)除内毒素的效率。（A）内毒素去(qù)除和定量的工(gōng)作流程。（B）測定和去(qù)除蛋白(bái)質樣品中(zhōng)的内毒素以備下(xià)遊應用。