近期已經證明，細胞外(wài)囊泡 (EV) 攜帶 DNA。然而，EV中(zhōng) DNA (EV-DNA) 的許多基本特征仍然難以捉摸。
2022年4月4日，廈門大(dà)學顔曉梅團隊在Journal of Extracellular Vesicles（IF=26）在線發表題爲“Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry”的研究論文，該研究通過納米流式細胞儀 (nFCM) 可以檢測直徑小(xiǎo)至 40 nm 的單個 EV 和 SYTO 16 染色後 200 bp 的單個 DNA 片段，用于研究單個囊泡處的 EV-DNA。
通過同時對單個顆粒進行側向散射和熒光 (FL) 檢測并結合酶處理，本研究表明：(1) 裸 DNA 或與非囊泡實體(tǐ)相關的 DNA 大(dà)量存在于由細胞培養物(wù)制備的 EV 樣品中(zhōng)（超速離(lí)心培養基）；(2) 單個 EVs 中(zhōng) EV-DNA 的數量表現出很大(dà)的異質性，DNA 陽性 (DNA+) EVs 的數量在 30% 到 80% 之間變化，具體(tǐ)取決于細胞類型；(3) 外(wài)部 EV-DNA 主要定位在相對較小(xiǎo)的 EVs 上（例如，HCT-15 細胞系 <100 nm），外(wài)部 DNA+ EVs 的分(fēn)泌可以通過抑制外(wài)泌體(tǐ)分(fēn)泌途徑顯著減少；(4) 内部 EV-DNA 主要封裝在相對較大(dà)的 EV 的管腔内（例如 HCT-15 細胞系爲 80-200 nm）；(5) 雙鏈 DNA (dsDNA) 是外(wài)部和内部 EV-DNA 的主要形式；(6) EVs 中(zhōng)未發現組蛋白(bái) (H3)，EV-DNA 與組蛋白(bái)不相關，(7) 基因毒性藥物(wù)誘導 DNA+ EVs 的釋放(fàng)增加，外(wài)部DNA+ EVs和内部DNA+ EVs的數量以及單個EVs中(zhōng)的DNA含量均顯着增加。這項研究爲深入了解 DNA 與EV的關聯提供了直接和确鑿的實驗證據。
細胞外(wài)囊泡 (EVs) 是由幾乎所有細胞類型分(fēn)泌的納米級膜囊泡，通過将蛋白(bái)質、核酸和脂質從供體(tǐ)細胞轉移到受體(tǐ)細胞來介導細胞間通訊。研究表明，EV中(zhōng)存在基因組 DNA、線粒體(tǐ) DNA 甚至病毒 DNA。通過 DNA 的包裝和水平轉移，EV 在維持細胞穩态、調節免疫反應和調節腫瘤進展方面發揮着重要的作用。
基于 EV 中(zhōng)的 DNA (EV-DNA) 開(kāi)發了用于腫瘤診斷的液體(tǐ)活檢測試。盡管已經認識到 EV-DNA 的生(shēng)物(wù)學意義，但對 EV-DNA 的探索較少，許多基本特征仍存在争議，例如 DNA 是否與所有或部分(fēn) EV 亞群相關？EV-DNA 是否位于内腔和/或 EV 表面？DNA含量和EV大(dà)小(xiǎo)之間有什麽關系？EV-DNA 是單鏈 DNA (ssDNA) 還是雙鏈 DNA (dsDNA)？對 EV-DNA 的研究通常通過從 EV 分(fēn)離(lí)物(wù)中(zhōng)提取 DNA，然後進行豐度、片段長度和序列評估來進行。通過将 DNase 酶消化與 Fragment Analyzer 系統相結合，研究了 DNA 的相對豐度和定位（管腔内或與 EV 表面相關）。爲了闡明 EV-DNA 在 EV 亞群之間的異質性，對分(fēn)離(lí)的 EV 進行 DNA 分(fēn)析通過密度梯度離(lí)心或不對稱流場-流分(fēn)餾已經進行。盡管批量分(fēn)析能夠識别不同 EV 亞群中(zhōng)的 DNA，但結果可能存在争議，因爲 EV-DNA 無法與無細胞 DNA 區分(fēn)開(kāi)來。由于 EV 的大(dà)小(xiǎo)和貨物(wù)含量差異很大(dà)，因此迫切需要單粒子技術來破譯 EV-DNA 的内在異質性，并将 EV-DNA 與遊離(lí) DNA 或其他污染物(wù)區分(fēn)開(kāi)來。然而，EV 的納米級粒徑（大(dà)多數大(dà)小(xiǎo) <100 nm）和 EV-DNA 的低含量使其成爲一(yī)個挑戰。
在過去(qù)的十年中(zhōng)，研究人員(yuán)一(yī)直緻力于開(kāi)發一(yī)種高靈敏度的納米流式細胞儀。它已實現對單個 EV、病毒、二氧化矽納米粒子和金納米粒子的光散射檢測，分(fēn)别小(xiǎo)至 40、27、24 和 7 nm。對于熒光 (FL) 檢測，檢測到單個 R-藻紅蛋白(bái)分(fēn)子的信噪比爲 17，有機染料的檢測限确定爲三個 Alexa Fluor 532 分(fēn)子。
在本研究中(zhōng)，嘗試通過将酶消化與 nFCM 相結合，在單囊泡水平上分(fēn)析外(wài)部和内部 EV-DNA。研究了 DNA+ EV 的百分(fēn)比以及 DNA 含量分(fēn)布與 EV 大(dà)小(xiǎo)、ssDNA 和 dsDNA 之間的區别、EV-DNA 和組蛋白(bái)的關聯以及抗癌藥物(wù)治療後 DNA 含量的改變。通過同時對單個顆粒進行側向散射和熒光 (FL) 檢測并結合酶處理，本研究表明：(1) 裸 DNA 或與非囊泡實體(tǐ)相關的 DNA 大(dà)量存在于由細胞培養物(wù)制備的 EV 樣品中(zhōng)（超速離(lí)心培養基）； (2) 單個 EVs 中(zhōng) EV-DNA 的數量表現出很大(dà)的異質性，DNA 陽性 (DNA+) EVs 的數量在 30% 到 80% 之間變化，具體(tǐ)取決于細胞類型； (3) 外(wài)部 EV-DNA 主要定位在相對較小(xiǎo)的 EVs 上（例如，HCT-15 細胞系 <100 nm），外(wài)部 DNA+ EVs 的分(fēn)泌可以通過抑制外(wài)泌體(tǐ)分(fēn)泌途徑顯著減少； (4) 内部 EV-DNA 主要封裝在相對較大(dà)的 EV 的管腔内（例如 HCT-15 細胞系爲 80-200 nm）； (5) 雙鏈 DNA (dsDNA) 是外(wài)部和内部 EV-DNA 的主要形式； (6) EVs 中(zhōng)未發現組蛋白(bái) (H3)，EV-DNA 與組蛋白(bái)不相關，(7) 基因毒性藥物(wù)誘導 DNA+ EVs 的釋放(fàng)增加，外(wài)部DNA+ EVs和内部DNA+ EVs的數量以及單個EVs中(zhōng)的DNA含量均顯着增加。這項研究爲深入了解 DNA 與EV的關聯提供了直接和确鑿的實驗證據。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12206
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