不管是在藥物(wù)研發還是基礎科研中(zhōng)，檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子的相互作用都是一(yī)類重要的實驗。小(xiǎo)分(fēn)子最主要的特點是分(fēn)子量較小(xiǎo)，一(yī)般在1000 Da以下(xià)；并且結構性質各異，部分(fēn)溶解度較差，需要使用有機溶劑（例如DMSO等）促溶；這些特點給相互作用的檢測帶來很大(dà)的挑戰。基于SPR（表面等離(lí)子體(tǐ)共振）原理的Biacore系統具有靈敏度高、可進行溶劑校正等優勢，不僅可以檢測較低的信号，且對分(fēn)子量差異懸殊的互作類型也能精确檢測，同時還能消除有機溶劑帶來的影響，因此越來越多的研究者選擇Biacore進行蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子相互作用檢測。

我(wǒ)們将根據智荟專線收集到的客戶反饋，針對Biacore系統檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子相互作用實驗中(zhōng)常出現的代表性問題，分(fēn)上下(xià)兩篇進行簡單的分(fēn)享與讨論。本篇爲上篇，将主要圍繞實驗設計和樣品準備方面的問題展開(kāi)介紹。

一(yī)、配體(tǐ)的固定策略以及芯片的選擇

對于配體(tǐ)（固定相）采用合理的固定方式并達到所需的固定量，是Biacore實驗邁向成功的第一(yī)步。然而所有基于傳感器表面的檢測技術，都會面臨“物(wù)質遷移效應”的影響，所以根據實驗類型及科學的偶聯量計算公式去(qù)控制偶聯量非常關鍵。爲此，目前僅有Biacore具備這樣嚴謹的計算公式，這其中(zhōng)固定量的計算方式主要就是參考以下(xià)核心方程式，并且其不僅适用于直接偶聯法的偶聯量計算，也可用于捕獲法的捕獲量計算：

公式中(zhōng)，RL爲配體(tǐ)的固定量，Rmax爲芯片表面的最大(dà)結合容量，Sm爲化學計量比（未知(zhī)情況時可先設爲1）。此公式可以簡單理解爲，Biacore中(zhōng)産生(shēng)的響應值信号反映的是芯片表面質量的變化。一(yī)般情況下(xià)，對于動力學分(fēn)析，要求Rmax ≤ 50 RU；對于親和力分(fēn)析，要求Rmax ≤ 100 RU。由此計算得到理論固定量RL，在偶聯法中(zhōng)實際固定量可能需要1.5~3RL；在捕獲法中(zhōng)，則可以按照理論固定量來設定配體(tǐ)的捕獲量，因爲捕獲過程的分(fēn)子朝向固定，條件一(yī)般也是溫和的接近中(zhōng)性，最大(dà)程度地保留的配體(tǐ)分(fēn)子的活性。

對于上面的核心方程式有了基本的了解之後，就可以回答下(xià)面這些問題了。

1是選擇固定蛋白(bái)還是固定小(xiǎo)分(fēn)子？

首先需要明确的是，如果您的實驗目的是想獲得精确的親和力數值，那建議選擇固定蛋白(bái)。考慮到小(xiǎo)分(fēn)子的固定難度、空間位阻以及固定過程對于結合的影響等方面的問題，選擇氨基偶聯的方式固定蛋白(bái)往往是最簡單、有效的固定方式。而小(xiǎo)分(fēn)子本身的活性基團有限，基團的反應活性也與蛋白(bái)存在一(yī)定的差異，偶聯條件需要摸索，另外(wài)，通過這些基團的偶聯反應可能也破壞了小(xiǎo)分(fēn)子僅有的結合反應活性位點。因此，隻有對于某些特定類型的定性實驗，比如分(fēn)子垂釣，固定小(xiǎo)分(fēn)子也是可行的，通常推薦的固定方式是使用SA芯片固定生(shēng)物(wù)素修飾後的小(xiǎo)分(fēn)子，可以在比較明确的條件下(xià)實現穩定的固定，而且生(shēng)物(wù)素分(fēn)子在一(yī)定程度上可以起到間隔臂（spacer arm）的作用，減少小(xiǎo)分(fēn)子結合受到的空間位阻影響。

綜上所述，固定蛋白(bái)的過程相對簡單也适用于大(dà)多數結合反應，因此是目前探究蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子互作時最常用的選擇。

2固定蛋白(bái)是選擇直接偶聯還是捕獲法？

先說結論：我(wǒ)們建議，進行蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子互作實驗時優先考慮直接偶聯蛋白(bái)的方式。

直接偶聯（氨基偶聯）法的操作方法較簡便、明确，而且可以實現較高的偶聯量，在小(xiǎo)分(fēn)子作爲分(fēn)析物(wù)時，有利于獲得比較理想的響應值。例如常用的CM5芯片，最高偶聯量可以到10000 – 15000 RU，非常适合蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子此類分(fēn)子量差異懸殊的檢測。除了直接偶聯法以外(wài)，根據樣品性質與分(fēn)子量差異，捕獲法也是一(yī)種您可以選擇的固定策略，例如：待固定的樣品未經純化，含有其他雜(zá)質；或者擔心直接偶聯的過程會影響結合位點等。在這些情況下(xià)，可以考慮通過捕獲法固定配體(tǐ)。當配體(tǐ)樣品的純度不夠時，捕獲的過程相當于在芯片表面進行了一(yī)次在線純化；捕獲過程的條件較爲溫和，可以盡可能地保留配體(tǐ)的結合活性，同時保證配體(tǐ)自由朝向，充分(fēn)暴露結合位點。

常用的捕獲類芯片以NTA芯片爲例，這是一(yī)種可以通過螯合鎳離(lí)子捕獲帶有His标簽蛋白(bái)的捕獲芯片。如下(xià)圖1所示，NTA芯片上捕獲量大(dà)約在3000 – 4000 RU[1]最爲穩定，非常适合His标簽蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子二者分(fēn)子量差異不是特别大(dà)的親和力檢測。

1. 在NTA芯片上，不同捕獲量水平下(xià)基線的穩定情況[1]。

3氨基偶聯蛋白(bái)配體(tǐ)是選擇CM5芯片還是CM7芯片？

CM5與CM7芯片表面均爲羧甲基化修飾的葡聚糖基質，兩者最主要的區别是CM7芯片的羧基含量顯著高于CM5芯片，因此可以實現更高的偶聯量。圖2比較了三對蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子的互作在CM5和CM7芯片上的結果差異，可以看到同一(yī)組互作實驗，在CM7芯片上可以達到的偶聯量和分(fēn)析物(wù)響應值爲CM5芯片的3倍以上 [2] 。

2. 三組蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子互作在CM5和CM7芯片上的偶聯量與分(fēn)析物(wù)響應值比較[2]。

如上所述，CM5芯片的最高偶聯量在10000 – 15000 RU左右，如果按照固定量計算公式得到的理論偶聯量遠超這個範圍，則可以考慮使用CM7芯片。簡單來說，當蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子的分(fēn)子量比值大(dà)于100時，就建議考慮換用CM7芯片。

二、樣品準備的相關問題

在确定了配體(tǐ)的固定策略，并選定了相應的芯片之後，就可以開(kāi)始下(xià)一(yī)步的實驗了。進入試劑、樣品的準備階段，又(yòu)會遇到哪些問題呢？我(wǒ)們接着往下(xià)看。

如何選擇運行緩沖液？

目前Cytiva供應的用于Biacore實驗的運行緩沖液主要有兩大(dà)類，分(fēn)别是基于HEPES緩沖體(tǐ)系的HBS系列緩沖液與基于磷酸鹽緩沖體(tǐ)系的PBS系列緩沖液。

在選擇運行緩沖液時，并沒有明确的規定必須使用何種緩沖液，應該根據分(fēn)子互作的自身性質選擇合适的緩沖液。一(yī)般來說，有以下(xià)經驗可供參考：當分(fēn)析物(wù)是小(xiǎo)分(fēn)子的情況下(xià)可以首先嘗試PBS 或者PBS-P+緩沖液；而分(fēn)析物(wù)爲蛋白(bái)時可以首先嘗試HBS或者HBS-EP+緩沖液。

在一(yī)些情況下(xià)，小(xiǎo)分(fēn)子的溶解需要一(yī)定濃度的有機溶劑助溶，例如5% DMSO等，而這些有機溶劑在不同樣品之間的濃度差異會幹擾響應值信号，因此需要對這部分(fēn)由運行緩沖液造成的信号進行校正——溶劑校正。而有機溶劑自動校正的功能，也是Biacore的絕活兒之一(yī)，充分(fēn)保證了最終實驗結果真實可信。關于溶劑校正的相關問題将在下(xià)篇中(zhōng)進行讨論。

需要準備多少的蛋白(bái)用來偶聯？

實驗準備的配體(tǐ)蛋白(bái)量，至少要足夠其達到所需的偶聯量。下(xià)表展示了要達到不同的偶聯水平時所需的配體(tǐ)濃度以及相應的配體(tǐ)偶聯時間（流速爲10 μL/min），可供參考[3]。需要注意的是，表中(zhōng)列出的“配體(tǐ)工(gōng)作濃度”是用偶聯緩沖液醋酸鈉稀釋配體(tǐ)蛋白(bái)樣品後的濃度。爲了讓稀釋後的蛋白(bái)樣品能夠充分(fēn)富集在芯片表面，醋酸鈉的稀釋倍數一(yī)般要在20倍以上；如果稀釋倍數不夠，将影響配體(tǐ)蛋白(bái)偶聯效率。因此，準備配體(tǐ)蛋白(bái)母液時最好在工(gōng)作濃度的20倍以上。

表1. 偶聯量與配體(tǐ)工(gōng)作濃度參考表[3]。

對于一(yī)個未知(zhī)的實驗，摸索合适的偶聯量等過程是必不可少的，因此對于蛋白(bái)配體(tǐ)的用量也不應僅限于夠一(yī)次偶聯實驗使用。一(yī)般的建議是，配體(tǐ)蛋白(bái)的準備量在1 mg/mL濃度、50 μL以上。但即便如此，老師們也能清晰的算出來Biacore對于蛋白(bái)的用量非常低，遠遠優于您其他的互作檢測手段。

小(xiǎo)分(fēn)子分(fēn)析物(wù)的濃度範圍如何确定？

不管在動力學（Kinetics）分(fēn)析還是在親和力（Affinity）分(fēn)析中(zhōng)，分(fēn)析物(wù)濃度範圍的确定均與結合反應的解離(lí)平衡常數（KD）有關。一(yī)般設置的分(fēn)析物(wù)濃度梯度範圍如果能夠覆蓋KD值，将會達到較準确的拟合結果。在動力學分(fēn)析中(zhōng)，一(yī)個理想的分(fēn)析物(wù)濃度範圍可以從10 × KD作爲最高濃度進行梯度稀釋；在親和力分(fēn)析中(zhōng)，理想的分(fēn)析物(wù)濃度範圍可以選擇從2 × KD的濃度作爲最高濃度進行梯度稀釋[4]。對于蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子的互作，大(dà)多數情況下(xià)是“快結合快解離(lí)”的模式，适用于親和力分(fēn)析的模型（關于數據分(fēn)析中(zhōng)模型選擇的問題，将會在下(xià)篇中(zhōng)進行讨論）。蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子結合反應的KD值，基本都在μM級别，因此可以将小(xiǎo)分(fēn)子最高濃度設爲1000 μM，按照3倍甚至5倍的稀釋比例來配制濃度梯度（拉大(dà)範圍）。進行這樣的初步實驗後，基本可以确定反應KD值的大(dà)緻範圍，後續可以調整濃度範圍、減小(xiǎo)稀釋比例再進行進一(yī)步實驗。當然，小(xiǎo)分(fēn)子能夠達到的最高濃度還受到溶解度等因素的影響。

以上是針對Biacore檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分(fēn)子互作的實驗方案設計以及樣品準備方面的常見問題分(fēn)享。良好的開(kāi)端是成功的一(yī)半，合理的活性配體(tǐ)偶聯量、分(fēn)析物(wù)濃度範圍以及運行緩沖液選擇，将幫助我(wǒ)們得到更理想的實驗結果。在下(xià)篇中(zhōng)我(wǒ)們将繼續分(fēn)享關于實驗進行以及數據分(fēn)析方面的常見問題，敬請期待！

文章來源：https://mp.weixin.qq.com/s/sG_kZkA5Kcdory0KPagPgw