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    技(jì )術幹貨:一文(wén)讀懂菌液OD600測量

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        微生物(wù)和細胞生長(cháng)的光密度(OD)測量是微生物(wù)學(xué)及生物(wù)發酵實驗室中(zhōng)最常用(yòng)的方法之一,用(yòng)于在進行蛋白表達或監測培養過程時确定收獲的最佳時間。細胞、細菌或酵母在液體(tǐ)培養基中(zhōng)的生長(cháng)情況(細胞密度、細菌生長(cháng)、酵母生長(cháng))通常通過測量600nm下的光密度(OD600)來獲得。OD600測量通常用(yòng)于确定細菌培養物(wù)的生長(cháng)階段,這些測量有(yǒu)助于确保在适當的細胞密度下收獲細胞。

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        由于OD600測量的光密度是由光散射而非光吸收引起的,因此細胞的大小(xiǎo)和形狀以及死細胞和碎片可(kě)能(néng)會增加光散射。因此,當在相同的儀器上測量時,處于相同密度水平(如Cells/mL)的不同細胞類型可(kě)能(néng)顯示出不同的OD600值。

        細菌細胞的生長(cháng)通常經曆一系列連續的階段,包括滞後、對數、靜止和衰退。通常,應在對數期結束時收獲細胞,使用(yòng)樣品的光密度OD600來确定何時達到這一時間點,是非常便捷的。在誘導或收獲之前,細胞通常常規生長(cháng)至OD600達到約0.4。

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    朗伯-比爾定律與OD600


        朗伯-比爾定律,根據經驗将光的吸收與樣品的濃度聯系起來。該定律表明,光通過特定樣品的透射率(T=I/Io,其中(zhōng)I=出射光,Io=入射光)、特定化合物(wù)的消光系數(ε)、樣品中(zhōng)具(jù)有(yǒu)光吸收的物(wù)質(zhì)的濃度(c)和光傳播的距離(d)之間存在對數關系。根據朗伯-比爾特定律,OD值與細菌濃度(C)或數量(N)具(jù)有(yǒu)類似的定義。然而,OD600的測量實際上是濁度的測量,因此,我們可(kě)以應用(yòng)朗伯-比爾定律定律,但需要進行一些額外的考量,如樣品濁度(濃度)的适用(yòng)範圍,設備收集非散射光的結構等。


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    OD600讀數的差異


        對于混濁的樣品,如細胞培養物(wù),測量的吸光度的主要來源于光散射,而不是完全遵循朗伯-比爾定律中(zhōng)的分(fēn)子吸收的原理(lǐ)。因此,測量取決于分(fēn)光光度計的光學(xué)設置(比色皿和儀器出射狹縫狹縫之間的距離、單色器的性能(néng)、狹縫幾何形狀等),不同的儀器類型很(hěn)可(kě)能(néng)會為(wèi)相同的混濁樣品提供不同的OD 600讀數。因此,如果要比較不同分(fēn)光光度計的結果,則必須首先使用(yòng)兩種不同儀器上的相同樣本進行OD600值比較,并進行相關性的歸一化。


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    OD600校正值公(gōng)式


        NanoPhotometer®或OD600 DiluPhotometer™等儀器默認“校正系數”為(wèi)1,如使用(yòng)相應方法進行調整,将有(yǒu)助于在不同設備之間提供可(kě)比較的結果。


    OD600校正因子= 設備1測量值 / 設備2測量值


        或者使用(yòng)創建适當的校準曲線(xiàn)來采用(yòng)更精(jīng)确的方法,可(kě)以通過在不同濃度範圍内比較測量的OD600與預期的OD600來構建校準曲線(xiàn)。預期的OD600是通過使用(yòng)替代技(jì )術(例如顯微鏡載玻片法)進行細胞計數,并使用(yòng)經驗法則将1個OD600=5×108個cells/ml的大腸杆菌聯系起來。


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        通常建議使用(yòng)試管或比色皿進行OD600測量,以确保讀數的穩定性,較大體(tǐ)積樣品提供了更大的濁度平均值,誤差相對較小(xiǎo)。此外,為(wèi)了防止菌體(tǐ)沉降過快,并給出随時間變化的OD讀數,可(kě)向樣品中(zhōng)添加甘油。對于一些很(hěn)小(xiǎo)的樣品量要求,使用(yòng)微滴進行測量,也是可(kě)行的,特别是NanoPhotometer®的樣品壓縮法,在液膜中(zhōng)測量,可(kě)避免液柱中(zhōng)顯著的沉降現象。但需注意在上樣前樣品的充分(fēn)混勻。

     

        用(yòng)于測量的儀器的線(xiàn)性範圍對于覆蓋培養物(wù)的整個生長(cháng)周期至關重要,建議至少2.5 OD的OD限值以提供足夠的工(gōng)作(zuò)範圍。如果存在大量的死細胞,使結果模糊不清,則樣本可(kě)能(néng)在整個範圍内不是線(xiàn)性的。如果樣品仍然超出範圍,則可(kě)能(néng)需要稀釋;應仔細選擇參數以覆蓋整個所需區(qū)域,而不影響測量的線(xiàn)性度。


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        為(wèi)了減少OD600測量所需的體(tǐ)積,并避免耗時且容易出錯的手動稀釋,可(kě)以使用(yòng)特殊的比色皿。Implen的DiluCell™自動稀釋比色皿可(kě)降低樣品體(tǐ)積要求,并提供自動虛拟樣品稀釋。由于DiluCell™的獨特設計,光路從标準的10毫米減少到1毫米(DC 10)。根據朗伯-比爾定律,光程因子為(wèi)10。使用(yòng)DiluCell™自動稀釋可(kě)節省時間,并排除稀釋誤差和交叉污染。


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        德(dé)國(guó)Implen提供多(duō)種OD600測量解決方案,包括應用(yòng)于基礎測量和高級工(gōng)藝開發的不同機型,具(jù)有(yǒu)可(kě)靠的測量結果和豐富的軟件功能(néng),以及合規性功能(néng),能(néng)夠充分(fēn)滿足不同用(yòng)戶的需求。OD600測量,認準德(dé)國(guó)Implen。


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