實驗一：肝素 (Heparin)

中(zhōng)南大學(xué)湘雅三醫(yī)院呂奔教授團隊圍繞膿毒症的發病機理(lǐ)及靶向幹預開展了系列研究，揭示了膿毒症重要的緻病機制，為(wèi)膿毒症的診治提供了潛在的生物(wù)标志(zhì)物(wù)和藥物(wù)幹預靶點，并針對該靶點進行藥物(wù)篩選，為(wèi)今後膿毒症的防治提供了新(xīn)的思路。

2021年，呂奔教授研究團隊在Immunity雜志(zhì)上發表文(wén)章，針對前序研究中(zhōng)發現的HMGB1-LPS-caspase-11途徑，篩選出肝素 (Heparin) 能(néng)高效并選擇性地抑制Caspase-11活化，并闡明了肝素在膿毒症中(zhōng)能(néng)通過抑制Caspase-11的活化防止髒器損傷、DIC發生和死亡的機制。

觀察圖1的動力學(xué)表征數據可(kě)知，肝素與HMGB1有(yǒu)較強結合，Kd=5.59*10^^-6 M。同時，通過多(duō)濃度梯度進樣的實驗設計，可(kě)以看出LPS+Heparin實驗組相較LPS對照組，與包被有(yǒu)HMGB1蛋白的芯片的響應值 (Response, RU) 顯著降低，即可(kě)看出Heparin可(kě)以抑制LPS與HMGB1的識别/結合。

實驗二：Tuftsin

北京大學(xué)王月丹與初明教授團隊圍繞着新(xīn)冠病毒的防治工(gōng)作(zuò)篩選到了一種天然産(chǎn)物(wù)Tuftsin，相關成果也于2022年發表在Frontiers in Molecular Biosciences雜志(zhì)上。Tuftsin是機體(tǐ)脾髒産(chǎn)生的一段生理(lǐ)活性肽，其基本功能(néng)是刺激巨噬細胞和粒細胞，提高促吞噬的能(néng)力；可(kě)以通過增強效應細胞的細胞毒功能(néng)殺傷腫瘤細胞等，在抗感染方面具(jù)有(yǒu)不能(néng)替代的作(zuò)用(yòng)。

通過多(duō)輪的化藥庫篩選、分(fēn)子對接等實驗，課題組篩選到Tuftsin分(fēn)子。随後，使用(yòng)Biacore體(tǐ)外驗證了其與ACE2分(fēn)子及抑制的效應分(fēn)子NRP1的親和力，結果表明Tuftsin能(néng)特異性識别并結合ACE2分(fēn)子。

此外，研究人員通過多(duō)濃度梯度進樣的實驗設計，将S1蛋白固定在CM5芯片上，設置ACE2 (5 nM) 對照組及Tuftsin+ACE2（ACE2為(wèi)固定濃度，5 nM; Tuftsin設置9/156/625 nM）實驗組；結果表明，Tuftsin濃度越高，結合響應值 (Response, RU) 越低，即證明Tuftsin可(kě)有(yǒu)效阻斷/抑制S1與ACE2的識别與結合。

實驗三：黃連素 (Berberine，BBR) 

首都醫(yī)科(kē)大學(xué)和北京中(zhōng)醫(yī)藥大學(xué)的科(kē)研團隊在傳統中(zhōng)藥中(zhōng)篩選特異性抑制凝血酶的小(xiǎo)分(fēn)子抑制劑，最終得到的黃連素 (Berberine，BBR) 被證明可(kě)以直接結合凝血酶從而抑制其誘導的血小(xiǎo)闆聚集。凝血酶 (Thrombin) 是血液凝固級聯反應中(zhōng)的關鍵酶，被認為(wèi)是多(duō)種心血管疾病中(zhōng)重要的藥物(wù)靶點。

研究人員首先在Biacore上證明了Berberine可(kě)以直接與凝血酶結合，兩者的親和力為(wèi)16.39 μM（圖3 A/B），比已上市的抗凝血藥阿加曲班 (Argatroban) 的親和力更高（圖3 C/D，KD=53.78 μM）。

同時，研究人員利用(yòng)Biacore的A-B-A進樣設計競争實驗，證明Berberine與Argatroban結合在Thrombin相同的位點上。A-B-A的進樣方式簡化了競争實驗的設置，允許兩種不同的溶液按照溶液A/溶液B/溶液A的順序在同一個循環内進樣，由于競争樣品無需再溶解在運行緩沖液裏，大大減少了競争樣品的消耗量，非常适用(yòng)于藥物(wù)的競争分(fēn)析（圖4）。

從圖5的實驗結果中(zhōng)可(kě)以看到：Berberine不存在時，Argatroban與Thrombin有(yǒu)明顯的結合信号（圖5，red line）；而在300 μM Berberine存在的情況下（A-B-A樣品設置參照圖4），Argatroban與Thrombin的結合響應值明顯降低（圖5，blue line）。證明Berberine在Thrombin上的結合位點與Argatroban是一樣的。綜合後續的血小(xiǎo)闆凝集實驗，這一研究說明Berberine是潛在的安(ān)全有(yǒu)效的凝血酶抑制藥物(wù)。

實驗一：紫草(cǎo)素 (SHK)

NF-κB是一個可(kě)誘導轉錄因子家族，調節多(duō)種生理(lǐ)及病理(lǐ)進程。NEMO/IKKβ複合物(wù)則是NF-κB信号通路中(zhōng)的中(zhōng)心調節劑。2022年，大連醫(yī)科(kē)大學(xué)馬骁馳、中(zhōng)國(guó)科(kē)學(xué)院上海藥物(wù)研究所果德(dé)安(ān)、中(zhōng)國(guó)科(kē)學(xué)院大連化學(xué)物(wù)理(lǐ)研究所葉明亮課題組在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志(zhì)上發表了相關成果，篩選到NEMO/IKKβ複合物(wù)的潛在抑制劑-紫草(cǎo)素 (SHK) 。

為(wèi)測得SHK抑制NEMO/IKKβ複合物(wù)的IC₅₀，課題組做了相關實驗：把MBP-IKKβ蛋白固定在CM5芯片上，再将GST-NEMO+SHK（GST-NEMO為(wèi)固定濃度，1 μM; SHK設置0~3125 nM）的預混液以多(duō)濃度梯度進樣的形式流過芯片表面，進行結合信号的采集，拟合作(zuò)圖，測出IC₅₀。

同時，課題組考慮到實驗的嚴謹性，将GST-NEMO作(zuò)為(wèi)固定相進行了實驗重複。課題組使用(yòng)Biacore測得了紫草(cǎo)素抑制NEMO/IKKβ複合物(wù)的IC₅₀為(wèi)174 nM，證明其可(kě)在體(tǐ)内外抑制NF-κB通路，從而減緩結直腸癌細胞的增殖，為(wèi)開發有(yǒu)效的小(xiǎo)分(fēn)子PPI抑制劑提供一些新(xīn)的思路。

倫斯勒理(lǐ)工(gōng)學(xué)院、中(zhōng)國(guó)農業大學(xué)等單位圍繞着綠茶中(zhōng)的抗氧化劑EGCG展開了豐富的研究，并于2021在NATURE COMMUNICATIONS雜志(zhì)上發表相關成果。文(wén)章中(zhōng)闡釋EGCG可(kě)與p53分(fēn)子結合并阻斷p53與MDM2分(fēn)子（E3泛素連接酶）的結合，從而抑制MDM2對p53的泛素化、穩定了p53的抗腫瘤活性。

課題組首先使用(yòng)Biacore測定了EGCG與全長(cháng)p53、NTD-p53的親和力，探明了EGCG與p53的識别作(zuò)用(yòng)靶點位于p53分(fēn)子的N末端。同時，課題組将MDM2分(fēn)子固定在CM5芯片上，探究了MDM2分(fēn)子與p53的親和力KD=0.6±0.1 μM。接着使用(yòng)同一張芯片展開了IC₅₀測試：将p53+EGCG（p53為(wèi)固定濃度，250 nM; EGCG設置0~500 nM）的預混液以多(duō)濃度梯度進樣的形式流過芯片表面，進行結合信号的采集，拟合作(zuò)圖，測出IC₅₀=0.2 μM。

小(xiǎo)結